Weefselverzameling en RNA-extractie uit het menselijke artrosekniegewricht
Summary
Primaire weefsels verkregen van patiënten na totale knieartroplastiek bieden een experimenteel model voor artroseonderzoek met maximale klinische vertaalbaarheid. Dit protocol beschrijft hoe RNA uit zeven unieke knieweefsels kan worden geïdentificeerd, verwerkt en geïsoleerd om mechanistisch onderzoek bij menselijke artrose te ondersteunen.
Abstract
Artrose (OA) is een chronische en degeneratieve gewrichtsaandoening die meestal de knie aantast. Omdat er momenteel geen genezing is, is totale knieartroplastiek (TKA) een veel voorkomende chirurgische ingreep. Experimenten met primaire menselijke OA-weefsels verkregen uit TKA bieden de mogelijkheid om ziektemechanismen ex vivote onderzoeken. Terwijl eerder werd gedacht dat artrose vooral het kraakbeen beïnvloedde, is nu bekend dat het meerdere weefsels in het gewricht beïnvloedt. Dit protocol beschrijft patiëntselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (gebaseerd op RNA-zuiverheid, integriteit en opbrengst) van elk van de zeven unieke weefsels ter ondersteuning van onderzoek naar ziektemechanismen in het kniegewricht. Met geïnformeerde toestemming werden monsters verkregen van patiënten die TKA voor artrose ondergingen. Weefsels werden ontleed, gewassen en opgeslagen binnen 4 uur na de operatie door flash freezing voor RNA of formaline fixatie voor histologie. Verzamelde weefsels omvatten gewrichtskraakbeen, subchondraal bot, meniscus, infrapatellair vetkussen, voorste kruisband, synovium en vastus medialis schuine spier. RNA-extractieprotocollen werden getest voor elk weefseltype. De belangrijkste modificatie betrof de methode van desintegratie die wordt gebruikt voor laagcellige, hoog-matrix, harde weefsels (beschouwd als kraakbeen, bot en meniscus) versus relatief hoogcellige, lage matrix, zachte weefsels (beschouwd als vetkussen, ligament, synovium en spier). Het bleek dat verpulvering geschikt was voor harde weefsels en homogenisatie geschikt was voor zachte weefsels. Een neiging voor sommige proefpersonen om hogere RNA-integriteitsgetalwaarden (RIN) op te leveren dan andere proefpersonen consistent over meerdere weefsels, wat suggereert dat onderliggende factoren zoals de ernst van de ziekte de RNA-kwaliteit kunnen beïnvloeden. Het vermogen om hoogwaardig RNA te isoleren uit primaire menselijke OA-weefsels biedt een fysiologisch relevant model voor geavanceerde genexpressie-experimenten, inclusief sequencing, die kunnen leiden tot klinische inzichten die gemakkelijker worden vertaald naar patiënten.
Introduction
De knie is het grootste synoviale gewricht in het menselijk lichaam, bestaande uit het tibiofemorale gewricht tussen het scheenbeen en het dijbeen en het patellofemorale gewricht tussen de patella en het dijbeen1. De botten in de knie zijn bekleed met gewrichtskraakbeen en worden ondersteund door verschillende bindweefsels, waaronder menisci, vet, ligamenten en spieren, en een synoviaal membraan kapselt het hele gewricht in om een met synoviale vloeistof gevulde holte1,2,3 te creëren(figuur 1). Een gezonde knie functioneert als een mobiel scharniergewricht dat wrijvingsloze beweging in het frontale vlak1,3mogelijk maakt. Onder pathologische omstandigheden kan beweging beperkt en pijnlijk worden. De meest voorkomende degeneratieve kniegewrichtsziekte is artrose (OA)4. Van een verscheidenheid aan risicofactoren is bekend dat ze vatbaar zijn voor de ontwikkeling van artrose, waaronder oudere leeftijd, obesitas, vrouwelijk geslacht, gewrichtstrauma en genetica, onder andere5,6. Er zijn momenteel naar schatting 14 miljoen mensen in de VS met symptomatische knie artrose, waarbij de prevalentie toeneemt als gevolg van de stijgende leeftijd van de bevolking en de percentages van obesitas7,8. Aanvankelijk beschouwd als een ziekte van het kraakbeen, wordt artrose nu begrepen als een ziekte van het hele gewricht9. Vaak waargenomen pathologische veranderingen in artrose omvatten gewrichtskraakbeenerosie, osteofytvorming, subchondrale botverdikking en ontsteking van het synovium9,10. Omdat er geen bekende remedie voor artrose is, richten behandelingen zich voornamelijk op symptoom (bijv. Pijn) management11,12,en zodra artrose is gevorderd tot het eindstadium, wordt gewrichtsvervangende chirurgie vaak geïndiceerd13.
Gewrichtsvervangende operaties kunnen gedeeltelijke of totale knieprothesen zijn, met totale kniearthroplastiek (TKA) inclusief het vervangen van de gehele tibiofemorale articulatie en het patellofemorale gewricht. Vanaf 2020 worden elk jaar ongeveer 1 miljoen TKAs uitgevoerd in de VS14. Tijdens TKA rekt een orthopedisch chirurg het bovenste deel van het tibiale plateau en de onderste femorale condylen (figuur 2A, 2B) om te worden uitgerust met prothetische implantaten. Soms verkeerd geïnterpreteerd door patiënten, wordt in een TKA slechts 8-10 mm gereseceerd vanaf het uiteinde van elk bot, dat vervolgens wordt afgedekt of opnieuw wordt opgedoken, met metaal. Een tussenliggende polyethyleen voering vormt het lageroppervlak (d.w.z. vulling) tussen de twee metalen implantaten. Bovendien worden verschillende zachte weefselcomponenten van het gewricht geheel of gedeeltelijk weggesneden om een goede gezamenlijke balans te bereiken. Onder deze weefsels bevinden zich de mediale en laterale menisci (figuur 2C), infrapatellaire vetkussen (figuur 2D), voorste kruisband (ACL; Figuur 2E), synovium (figuur 2F) en vastus medialis schuine spier (VMO; Figuur 2G) 15. Hoewel TKAs over het algemeen succesvol zijn voor artrosebehandeling, meldt ongeveer 20% van de patiënten herhaling van pijn na de operatie16. Samen met de hoge kosten en relatieve invasiviteit van de procedure, wijzen deze beperkingen op de noodzaak van verder onderzoek om alternatieve behandelingen te identificeren om de progressie van artrose te verminderen.
Om ziektemechanismen in artrose te onderzoeken die nieuwe wegen voor therapeutische interventie kunnen bieden, kunnen experimentele systemen, waaronder cellen, weefselexplantaten en diermodellen worden gebruikt. Cellen worden meestal gekweekt in monolaag en zijn afgeleid van primaire menselijke of dierlijke weefsels (bijv. Chondrocyten geïsoleerd uit kraakbeen) of vereeuwigde cellen (bijv. ATDC517 en CHON-00118). Hoewel cellen nuttig kunnen zijn voor het manipuleren van experimentele variabelen in een gecontroleerde kweekomgeving, vangen ze geen omstandigheden van het natuurlijke gewricht op waarvan bekend is dat ze celfenotypenbeïnvloeden 19. Om de complexe cascade van chemische, mechanische en cel-naar-cel communicatie die ten grondslag ligt aan artrose beter samen te vatten, wordt een alternatief gevonden in primaire menselijke of dierlijke weefselmonsters, ongeacht of ze vers of ex vivo als explantaten worden gebruikt, om de weefselstructuur en de celmicro-omgeving te behouden20. Om het gewricht in vivote bestuderen, zijn kleine (bijv. muis21)en grote (bijv. paard22)diermodellen voor artrose (bijv. door chirurgische inductie, genetische verandering of veroudering) ook nuttig. De vertaling van deze modellen naar menselijke ziekten kan echter worden beperkt door anatomische, fysiologische en metabole verschillen, onder andere23. Gezien de voor- en nadelen van experimentele systemen, maximaliseren de belangrijkste sterke punten van het soortspecifiek zijn en het handhaven van de extracellulaire niche die wordt aangeboden door de primaire menselijke OA-weefsels het translationele potentieel van onderzoeksresultaten.
Primaire menselijke OA-weefsels kunnen gemakkelijk worden verkregen na TKA, waardoor de hoge frequentie van TKA’s een waardevolle bron voor onderzoek is. Tot de mogelijke experimentele toepassingen behoren genexpressie en histologische analyses. Om het potentieel van primaire menselijke OA-weefsels voor deze onderzoeksbenaderingen en andere te realiseren, worden de volgende belangrijke overwegingen geschetst. Ten eerste is het gebruik van patiëntspecimens onderworpen aan ethische regelgeving en moeten protocollen voldoen aan de goedkeuringen van de Institutional Review Board (IRB)24. Ten tweede creëren de inherente heterogeniteit van menselijke primaire zieke weefsels en de invloed van variabelen zoals leeftijd en geslacht, onder andere, de behoefte aan zorgvuldige patiëntenselectie (d.w.z. toepassing van subsidiabiliteitscriteria) en gegevensinterpretatie. Ten derde kunnen de unieke biologische eigenschappen van verschillende weefsels in het gewricht (bijv. Lage cellulariteit van kraakbeen en meniscus25) uitdagingen opleveren tijdens experimenten (bijvoorbeeld het isoleren van hoge kwaliteit en kwantiteit van RNA). Dit rapport behandelt deze overwegingen en presenteert een protocol voor patiëntenselectie, monsterverwerking, weefselhomogenisatie, RNA-extractie en kwaliteitscontrole (d.w.z. beoordeling van RNA-zuiverheid en -integriteit; Figuur 3) het gebruik van primaire menselijke artroseweefsels in de onderzoeksgemeenschap aan te moedigen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het gepresenteerde protocol is succesvol gebleken voor het verzamelen van zeven primaire menselijke OA-weefsels voorRNA-extractie( tabel 1 ) en histologische verwerking (figuur 4). Voorafgaand aan het verzamelen van patiëntmonsters, is het noodzakelijk om een IRB-goedgekeurd protocol op te stellen, idealiter in samenwerking met een chirurg of chirurgisch team. Het toepassen van een gestandaardiseerd protocol voor het verzamelen van monsters (bijv. Resectie van consistente <…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs bedanken de studiedeelnemers die dit onderzoek mogelijk hebben gemaakt en dragen dit rapport op aan nieuwe wetenschappers op het gebied van artrose.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
Referenzen
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
- Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
- O’Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
- Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
- Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
- Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
- Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
- Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
- Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
- Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
- Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
- Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
- Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
- Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
- Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
- Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
- Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
- Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
- Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
- Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
- Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
- Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
- Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).
