Сбор тканей и извлечение РНК из остеоартритного коленного сустава человека
Summary
Первичные ткани, полученные от пациентов после тотальной эндопротезирования коленного сустава, обеспечивают экспериментальную модель для исследования остеоартрита с максимальной клинической переводимостью. Этот протокол описывает, как идентифицировать, обрабатывать и изолировать РНК из семи уникальных тканей коленного сустава для поддержки механистического исследования остеоартрита человека.
Abstract
Остеоартрит (ОА) является хроническим и дегенеративным заболеванием суставов, чаще всего поражающим коленное. Поскольку в настоящее время нет лечения, тотальная эндопротезирование коленного сустава (ТКА) является распространенным хирургическим вмешательством. Эксперименты с использованием первичных тканей ОА человека, полученных из ТКА, дают возможность исследовать механизмы заболевания ex vivo. В то время как ранее считалось, что ОА влияет в основном на хрящ, теперь известно, что он влияет на несколько тканей в суставе. Этот протокол описывает отбор пациента, обработку образцов, гомогенизацию тканей, экстракцию РНК и контроль качества (на основе чистоты, целостности и выхода РНК) из каждой из семи уникальных тканей для поддержки исследования механизма заболевания в коленном суставе. С информированного согласия образцы были получены от пациентов, перенесших ТКА для ОА. Ткани рассекались, промывались и хранились в течение 4 ч после операции путем мгновенного замораживания для фиксации РНК или формалина для гистологии. Собранные ткани включали суставной хрящ, субхондральную кость, мениск, инфрапателларную жировую прокладку, передовую крестообразную связку, синовиальную часть и косую мышцу vastus medialis. Протоколы экстракции РНК были протестированы для каждого типа ткани. Наиболее значительная модификация включала метод распада, используемый для низкоклеточных, высокоматричных, твердых тканей (рассматриваемых как хрящ, кость и мениск) по сравнению с относительно высококлеточными, низкоматриксными, мягкими тканями (рассматриваемыми как жировая подушка, связка, синовий и мышца). Было обнаружено, что измельчение подходит для твердых тканей, а гомогенизация подходит для мягких тканей. Наблюдалась склонность некоторых субъектов давать более высокие значения целостности РНК (RIN), чем у других субъектов, последовательно в нескольких тканях, предполагая, что основные факторы, такие как тяжесть заболевания, могут влиять на качество РНК. Способность выделять высококачественную РНК из первичных тканей ОА человека обеспечивает физиологически релевантную модель для сложных экспериментов по экспрессии генов, включая секвенирование, которые могут привести к клиническим выводам, которые легче транслируются пациентам.
Introduction
Колено является самым большим синовиальным суставом в организме человека, состоящим из большеберцового бедренного сустава между большеберцовой и бедренной голенями и надколенника между коленной чашечкой и бедреннойкостью 1. Кости в колене выстрены суставным хрящом и поддерживаются различными соединительными тканями, включая мениски, жир, связки и мышцы, а синовиальная мембрана инкапсулирует весь сустав для создания заполненной синовиальной жидкостью полости1,2,3 (рисунок 1). Здоровое колено функционирует как подвижное шарнирное соединение, которое позволяет беспрепятственно передергиваться в лобной плоскости1,3. При патологических состояниях движение может стать ограниченным и болезненным. Наиболее распространенным дегенеративным заболеванием коленного сустава является остеоартрит (ОА)4. Известно, что различные факторы риска предрасполагают к развитию ОА, включая пожилой возраст, ожирение, женский пол, травму суставов и генетику, среди прочих5,6. В настоящее время, по оценкам, в США с симптоматическим ОА коленного сустава насчитывается 14 миллионов человек, причем распространенность увеличивается из-за роста возраста населения и показателей ожирения7,8. Первоначально считавшийся заболеванием хряща, ОА теперь понимается как заболевание всего сустава9. Обычно наблюдаемые патологические изменения при ОА включают эрозию суставного хряща, образование остеофита, утолщение субхондральной кости и воспаление синовиальнойчасти 9,10. Поскольку не существует известного лечения ОА, лечение в основном сосредоточено на лечении симптомов (например, боли)11,12,и как только ОА прогрессирует до конечной стадии, операция по замене сустава часто указывается13.
Операции по замене сустава могут быть частичной или полной заменой коленного сустава, с полной артропластикой коленного сустава (TKA), включая замену всего тибиофеморального сочленения и пателлофеморального сустава. По состоянию на 2020 год в США ежегодно выполняется около 1 миллиона ТКА14. Во время TKA хирург-ортопед резецирует верхнюю часть плато большеберцовой кости и нижние мыщелки бедренной кости(рисунок 2A,2B),которые должны быть установлены протезными имплантатами. Иногда неправильно интерпретируемые пациентами, в ТКА только 8-10 мм резецируется с конца каждой кости, которая впоследствии укупоривается или всплывается металлом. Вставной полиэтиленовый вкладыш образует несущую поверхность (т.е. прокладку) между двумя металлическими имплантатами. Кроме того, несколько компонентов мягких тканей сустава полностью или частично иссякают для достижения правильного баланса сустава. К числу этих тканей относятся медиал и латеральные мениски(рисунок 2С),инфрапателлярная жироваяподушка (рисунок 2D),передняя крестообразная связка (ПКС; Рисунок 2E),синовиум(Рисунок 2F)и vastus medialis косая мышца (VMO; Рисунок 2G) 15. Хотя ТКА, как правило, успешны для лечения ОА, около 20% пациентов сообщают о повторном возникновении боли после операции16. Наряду с высокой стоимостью и относительной инвазивностью процедуры, эти ограничения указывают на необходимость дальнейших исследований для выявления альтернативных методов лечения для смягчения прогрессирования ОА.
Для изучения механизмов заболевания при ОА, которые могут представлять новые возможности для терапевтического вмешательства, могут быть использованы экспериментальные системы, включая клетки, тканевые экспланты и животные модели. Клетки обычно культивируются в монослое и получают из первичных тканей человека или животных (например, хондроцитов, выделенных из хряща) или увековеченных клеток (например, ATDC517 и CHON-00118). Хотя клетки могут быть полезны для манипулирования экспериментальными переменными в контролируемой среде культуры, они не захватывают условия естественного сустава, которые, как известно, влияют на фенотипы клеток19. Чтобы лучше резюмировать сложный каскад химической, механической и межклеточной коммуникации, лежащей в основе ОА, альтернатива найдена в первичных образцах тканей человека или животных, независимо от того, используются ли они в свежем или культивируемом ex vivo в качестве эксплантов, для сохранения структуры ткани и микроокружения клеток20. Для изучения сустава in vivoтакже полезны маленькие (например, мышь21)и большие (например, лошадь22)животные модели для ОА (например, посредством хирургической индукции, генетического изменения или старения). Однако перевод от этих моделей к заболеваниям человека может быть ограничен анатомическими, физиологическими и метаболическими различиями, среди прочих23. Учитывая преимущества и недостатки экспериментальных систем, ключевые сильные стороны видовой специфики и поддержания внеклеточной ниши, предлагаемой первичными тканями ОА человека, максимизируют трансляционный потенциал результатов исследований.
Первичные ткани ОА человека могут быть легко получены после ТКА, что делает высокую частоту ТКА ценным ресурсом для исследований. Среди потенциальных экспериментальных применений — экспрессия генов и гистологический анализ. Чтобы реализовать потенциал первичных тканей ОА человека для этих исследовательских подходов и других, изложены следующие ключевые соображения. Во-первых, использование образцов пациентов подлежит этическому регулированию, и протоколы должны соответствовать утверждениям Институционального наблюдательного совета (IRB)24. Во-вторых, присущая человеку гетерогенность первичных пораженных тканей и влияние таких переменных, как возраст и пол, среди прочего, создают необходимость тщательного отбора пациентов (т.е. применения критериев приемлемости) и интерпретации данных. В-третьих, уникальные биологические свойства различных тканей в суставе (например, низкая клеточность хряща и мениска25)могут представлять проблемы во время экспериментов (например, выделение высокого качества и количества РНК). В этом отчете рассматриваются эти соображения и представлен протокол для отбора пациентов, обработки образцов, гомогенизации тканей, экстракции РНК и контроля качества (т.е. оценки чистоты и целостности РНК; Рисунок 3) поощрять использование первичных тканей ОА человека в исследовательском сообществе.
Protocol
Representative Results
Discussion
Представленный протокол оказался успешным для сбора семи первичных тканей ОА человека для экстракции РНК(таблица 1)и гистологической обработки(рисунок 4). Перед сбором образцов пациента необходимо установить протокол, одобренный IRB, в идеале в сотрудничестве с…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят участников исследования, которые сделали это исследование возможным, и посвящают этот отчет новым ученым в области остеоартрита.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Eppendorf | 05 402 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 10% Formalin | Cardinal Health | C4320-101 | Store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Chloroform (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | ICN19400290 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Ethanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | BP2818500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, when diluting use DEPC/nuclease-free water. |
| 100% Isopropanol (Molecular Biology Grade) | Fisher Scientific | AC327272500 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only, store in chemical cabinet when not in use. |
| 100% Reagent Alcohol | Cardinal Health | C4305 | Diluted to 70% with dH2O for cleaning purposes. |
| 15 cm sterile culture dishes | Thermo Scientific | 12-556-003 | Sterile, nuclease-free. |
| 15 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 14 959 53A | Sterile, nuclease-free. |
| 2 mL cryovials (externally threaded) | Fisher Scientific | 10 500 26 | Sterile, nuclease-free. |
| 5 mL round-bottom tubes | Corning | 352052 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
| 50 mL polypropylene (Falcon) tubes | Fisher Scientific | 12 565 271 | Sterile, nuclease-free. |
| Bioanalyzer | Agilent | G2939BA | For RNA integrity measurement. |
| Biosafety Cabinet | General lab equipment | ||
| Bone Cutters | Fisher Scientific | 08 990 | Sterilized with 70% EtOH. |
| Chemical Fume Hood | General lab equipment | ||
| Disposable Scalpels (No.10) | Thermo Scientific | 3120032 | Sterile, nuclease-free. |
| EDTA | Life Technologies | 15-576-028 | 10% solution with dH2O. |
| Forceps | Any vendor | Sterilized with 70% EtOH. | |
| Glycoblue Coprecipitant | Fisher Scientific | AM9516 | Reserved for RNA work only, store at -20 °C. |
| Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666 | |
| Liquid Nitrogen | Any vendor | ||
| Liquid Nitrogen Dewar | General lab equipment | ||
| Mortar and Pestle | Any vendor | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. | |
| Nanodrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA purity and yield measurements. |
| Nuclease-free/DEPC-treated water | Fisher Scientific | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. | |
| PBS (Sterile) | Gibco | 20 012 050 | Sterile, nuclease-free. |
| Pipettes (2 µL, 20 µL, 200 µL, 1000 µL) & tips | Any vendor | Sterile, nuclease-free. | |
| Plasma/Serum Advanced miRNA kit | Qiagen | 217204 | |
| Refrigerated Centrifuge 5810R | Eppendorf | 22625101 | |
| RNAlater | Thermo Scientific | 50 197 8158 | Sterile, nuclease-free. |
| RNAse Away/RNAseZap | Fisher Scientific | 7002 |
|
| Spatula (semimicro size) | Any vendor | Reserved for RNA work only. | |
| Tissue homogenizer | Pro Scientific | 01-01200 | Reserved for RNA work only, sterilzed per protocol. |
| TRIzol Reagent | Fisher Scientific | 15 596 026 | Sterile, nuclease-free. Reserved for RNA work only. |
Referenzen
- Gupton, M., Imonugo, O., Terreberry, R. R. . Anatomy, Bony Pelvis, and Lover Limb, Knee. , (2020).
- Pacifici, M., Koyama, E., Iwamoto, M. Mechanisms of Synovial joint and articular cartilage formation: recent advances, but many lingering mysteries. Birth Defects Research Part C: Embryo Today: Reviews. 75 (3), 237-248 (2005).
- Gupton, M., Munjal, A., Terreberry, R. R. . Anatomy, Hinge Joints. , (2020).
- Chen, D., et al. Osteoarthritis: Toward a comprehensive understanding of pathological mechanism. Bone Research. 5, 16044 (2017).
- Murphy, L., et al. Lifetime risk of symptomatic knee osteoarthritis. Arthritis & Rheumatism. 59 (9), 1207-1213 (2008).
- O’Neill, T. W., McCabe, P. S., McBeth, J. Update on the epidemiology, risk factors and disease outcomes of osteoarthritis. Best Practice & Research: Clinical Anaesthesiology. 32 (2), 312-326 (2018).
- Nguyen, U. S., et al. Increasing prevalence of knee pain and symptomatic knee osteoarthritis: survey and cohort data. Annals of Internal Medicine. 155 (11), 725-732 (2011).
- Deshpande, B. R., et al. Number of persons with symptomatic knee osteoarthritis in the us: impact of race and ethnicity, age, sex, and obesity. Arthritis Care & Research. 68 (12), 1743-1750 (2016).
- Loeser, R. F., Goldring, S. R., Scanzello, C. R., Goldring, M. B. Osteoarthritis: a disease of the joint as an organ. Arthritis & Rheumatism. 64 (6), 1697-1707 (2012).
- McGonagle, D., Tan, A. L., Carey, J., Benjamin, M. The anatomical basis for a novel classification of osteoarthritis and allied disorders. Journal of Anatomy. 216 (3), 279-291 (2010).
- Bannuru, R. R., et al. OARSI guidelines for the non-surgical management of knee, hip, and polyarticular osteoarthritis. Osteoarthritis Cartilage. 27 (11), 1578-1589 (2019).
- Kolasinski, S. L., et al. American College of Rheumatology/Arthritis Foundation Guideline for the Management of Osteoarthritis of the Hand, Hip, and knee. Arthritis Care & Research. 72 (2), 220-233 (2020).
- Michael, J. W., Schluter-Brust, K. U., Eysel, P. The epidemiology, etiology, diagnosis, and treatment of osteoarthritis of the knee. Deutsches Ärzteblatt International. 107 (9), 152-162 (2010).
- Singh, J. A., Yu, S., Chen, L., Cleveland, J. D. Rates of total joint replacement in the United States: Future projections to 2020-2040 using the national inpatient sample. Journal of Rheumatology. 46 (9), 1134-1140 (2019).
- Gemayel, A. C., Varacallo, M. Total Knee Replacement Techniques. StatPearls. , (2020).
- Shan, L., Shan, B., Suzuki, A., Nouh, F., Saxena, A. Intermediate and long-term quality of life after total knee replacement: a systematic review and meta-analysis. Journal of Bone and Joint Surgery (American Volume). 97 (2), 156-168 (2015).
- Newton, P. T., et al. Chondrogenic Atdc5 cells: an optimised model for rapid and physiological matrix mineralisation. International Journal of Molecular Medicine. 30 (5), 1187-1193 (2012).
- Chuang, Y. W., et al. Lysophosphatidic acid enhanced the angiogenic capability of human chondrocytes by regulating Gi/Nf-Kb-dependent angiogenic factor expression. PLoS One. 9 (5), 95180 (2014).
- Johnson, C. I., Argyle, D. J., Clements, D. N. In vitro models for the study of osteoarthritis. Veterinary Journal. 209, 40-49 (2016).
- Grivel, J. C., Margolis, L. Use of human tissue explants to study human infectious agents. Nature Protocols. 4 (2), 256-269 (2009).
- Glasson, S. S., Blanchet, T. J., Morris, E. A. The surgical destabilization of the medial meniscus (dmm) model of osteoarthritis in the 129/Svev mouse. Osteoarthritis Cartilage. 15 (9), 1061-1069 (2007).
- McIlwraith, C. W., Frisbie, D. D., Kawcak, C. E. The horse as a model of naturally occurring osteoarthritis. Bone & Joint Research. 1 (11), 297-309 (2012).
- Cope, P. J., Ourradi, K., Li, Y., Sharif, M. Models of Osteoarthritis: The good, the bad and the promising. Osteoarthritis Cartilage. 27 (2), 230-239 (2019).
- Goldenberg, A. J., et al. IRB practices and policies regarding the secondary research use of biospecimens. Bmc Medical Ethics. 16, 32 (2015).
- Ruettger, A., Neumann, S., Wiederanders, B., Huber, R. Comparison of different methods for preparation and characterization of total rna from cartilage samples to uncover osteoarthritis in vivo. BMC Research Notes. 3, 7 (2010).
- Reno, C., Marchuk, L., Sciore, P., Frank, C. B., Hart, D. A. Rapid isolation of total RNA from small samples of hypocellular, dense connective tissues. BioTechniques. 22 (6), 1082-1086 (1997).
- Fox, A. J., Bedi, A., Rodeo, S. A. The basic science of human knee menisci: structure, composition, and function. Sports Health. 4 (4), 340-351 (2012).
- Carballo, C. B., Nakagawa, Y., Sekiya, I., Rodeo, S. A. Basic science of articular cartilage. Clinics in Sports Medicine. 36 (3), 413-425 (2017).
- Le Bleu, H. K., et al. Extraction of high-quality RNA from human articular cartilage. Analytical Biochemistry. 518, 134-138 (2017).
- Ali, S. A., Alman, B. RNA extraction from human articular cartilage by chondrocyte isolation. Analytical Biochemistry. 429 (1), 39-41 (2012).
- Schroeder, A., et al. The Rin: An RNA integrity number for assigning integrity values to rna measurements. BMC Molecular Biology. 7, 3 (2006).
- Li, S., et al. Multi-platform assessment of transcriptome profiling using RNA-seq in the abrf next-generation sequencing study. Nature Biotechnology. 32 (9), 915-925 (2014).
- Nazarov, P. V., et al. RNA sequencing and transcriptome arrays analyses show opposing results for alternative splicing in patient derived samples. BMC Genomics. 18 (1), 443 (2017).
- Madissoon, E., et al. scRNA-seq assessment of the human lung, spleen, and esophagus tissue stability after cold preservation. Genome Biology. 21 (1), (2019).
- Scholes, A. N., Lewis, J. A. Comparison of RNA isolation methods on RNA-seq: implications for differential expression and meta-analyses. BMC Genomics. 21 (1), 249 (2020).
- Smith, M. D. The normal synovium. Open Rheumatology Journal. 5, 100-106 (2011).
- Kukurba, K. R., Montgomery, S. B. RNA sequencing and analysis. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (11), 951-969 (2015).
- Mobasheri, A., Kapoor, M., Ali, S. A., Lang, A., Madry, H. The future of deep phenotyping in osteoarthritis: how can high throughput omics technologies advance our understanding of the cellular and molecular taxonomy of the disease. Osteoarthritis and Cartilage Open. 3 (2), 100144 (2021).
