מערכת זלוף ריאות מבודדת במודל הארנב
Summary
הכנת ריאות ארנב מבודד הוא כלי סטנדרטי זהב במחקר ריאתי. פרסום זה נועד לתאר את הטכניקה כפי שפותחה לחקר מנגנונים פיזיולוגיים ופתולוגיים המעורבים בתגובה בדרכי הנשימה, שימור ריאות ומחקר פרה-אקליני בהשתלת ריאות ובבצקת ריאות.
Abstract
מערכת זלוף הריאות המבודדת נמצאת בשימוש נרחב במחקר ריאתי, ותרמה לתרומת הפעילות הפנימית של הריאות, הן מיקרו והן מקרוסקופית. טכניקה זו שימושית באפיון פיזיולוגיה ופתולוגיה ריאתית על ידי מדידת פעילויות מטבוליות ותפקודים נשימתיים, כולל אינטראקציות בין חומרים במחזור הדם והשפעות של חומרים בשאיפה או חדורים, כמו בבדיקות סמים. בעוד שיטות במבחנה כרוכות חיתוך פולחן של רקמות, מערכת זלוף ריאות ex vivo מבודד מאפשר לעבוד עם איבר פונקציונלי מלא המאפשר את המחקר של פונקציה פיזיולוגית מתמשכת תוך יצירה מחדש של אוורור וזלוף. עם זאת, יש לציין כי ההשפעות של היעדר innervation מרכזי ניקוז לימפתי עדיין צריך להיות מוערך במלואו. פרוטוקול זה נועד לתאר את ההרכבה של מנגנון הריאות המבודד, ואחריו מיצוי כירורגי ו cannulation של ריאות ולב מחיות מעבדה ניסיוניות, כמו גם להציג את טכניקת זלוף ועיבוד אותות של נתונים. הכדאיות הממוצעת של הריאות המבודדות נעה בין 5-8 שעות; במהלך תקופה זו, חמיץ נימים ריאתי עולה, גרימת בצקת ופגיעה בריאות. הפונקציונליות של רקמת ריאות שהשתמרה נמדדת על ידי מקדם סינון נימי (Kfc), המשמש לקביעת היקף בצקת הריאות לאורך זמן.
Introduction
ברודי ודיקסון תיארו לראשונה את מערכת זלוף הריאות לשעבר בשנת 1903 1. מאז, הוא הפך לכלי תקן זהב לחקר הפיזיולוגיה, הפרמקולוגיה, טוקסיקולוגיה וביוכימיה של הריאות2,3. הטכניקה מציעה דרך עקבית וניתנת לשחזור להעריך את הכדאיות של השתלות ריאות, ולקבוע את ההשפעה של מתווכים דלקתיים כגון היסטמין, מטבוליטים חומצה ארכידונית, וחומר P, בין היתר, כמו גם את האינטראקציות שלהם במהלך תופעות ריאות כגון ברונכוקונסטריה, אטלקטטזיס, בצקת ריאות. מערכת הריאות המבודדת הייתה טכניקה מרכזית בחשוף התפקיד החשוב של הריאות בחיסול אמינים ביוגניים ממחזור הדם הכללי4,5. בנוסף, המערכת שימשה להערכת הביוכימיה של פעילי שטח ריאתיים6. במהלך העשורים האחרונים, מערכת זלוף הריאות לשעבר הפכה לפלטפורמה אידיאלית למחקר השתלת ריאות7. בשנת 2001 תיאר צוות בראשות סטיג סטיין את היישום הקליני הראשון של מערכת זלוף הריאות ex-vivo על ידי שימוש בו כדי לשחזר את ריאותיו של תורם בן 19, שנדחה בתחילה על ידי מרכזי השתלה בשל פציעותיו. הריאה השמאלית נקצרה וחולבה במשך 65 דקות; לאחר מכן, הוא הושתל בהצלחה בגבר בן 70 עם COPD8. מחקר נוסף על שיפוץ ריאות באמצעות זלוף ex-vivo הוביל לפיתוח טכניקת טורונטו עבור זלוף ריאות מורחב כדי להעריך ולטפל ריאות תורם פצוע9,10. מבחינה קלינית, מערכת זלוף הריאות ex-vivo הוכיחה להיות אסטרטגיה בטוחה כדי להגדיל את מאגרי התורמים על ידי טיפול ושיפוץ ריאות תורם תת-סטנדרטי, הצגת שום הבדל משמעותי בסיכונים או תוצאות נגד תורמים קריטריונים סטנדרטיים10.
היתרון העיקרי של מערכת זלוף הריאות המבודדת הוא שניתן להעריך את הפרמטרים הניסיוניים באיבר פונקציונלי מלא המשמר את תפקודו הפיזיולוגי תחת מערך מעבדה מלאכותי. יתר על כן, הוא מאפשר מדידה ומניפולציה של אוורור מכני ריאתי לנתח את המרכיבים של פיזיולוגיה ריאתית כגון התנגדות דרכי הנשימה, התנגדות כלי דם כוללת, חילופי גזים, היווצרות בצקת, אשר עד כה לא ניתן למדוד בדיוק vivo על חיות מעבדה2. ראוי לציין, את הרכב הפתרון שבו הריאה מנוטרלת ניתן לשלוט באופן מלא, המאפשר תוספת של חומרים כדי להעריך את ההשפעות שלהם בזמן אמת איסוף מדגם מ זלוף למחקר נוסף11. חוקרים העובדים עם מערכת הריאות המבודדת צריכים לזכור כי אוורור מכני גורם לריקבון רקמת הריאה המקצרת את זמן השימוש שלה. נפילה הדרגתית זו בפרמטרים מכניים יכולה להתעכב באופן משמעותי על ידי ניפוח יתר של הריאות מדי פעם במהלך הניסוי4. ובכל זאת, ההכנה בדרך כלל לא יכולה להימשך יותר משמונה שעות. שיקול נוסף במערכת זלוף הריאות לשעבר הוא היעדר ויסות עצבים מרכזי וניקוז לימפתי. ההשפעות של היעדרם עדיין לא מובנות במלואן ועלול להיות מקור להטיה בניסויים מסוימים.
טכניקת מערכת זלוף הריאות המבודדת יכולה להתבצע במודל הארנב עם רמה גבוהה של עקביות ושחזור. עבודה זו מתארת את ההליכים הטכניים והניתוחיים ליישום טכניקת זלוף הריאות המבודדת ex-vivo כפי שפותחה עבור מודל הארנב במכון נאסיונאל דה אנפרמדדס Respiratorias במקסיקו סיטי, בכוונה לחלוק את התובנות ולספק מדריך ברור על צעדים מרכזיים ביישום מודל ניסיוני זה.
Protocol
Representative Results
Discussion
עבודה זו מציגה מבט כללי על מערכת זלוף הריאות המבודדת, טכניקה חיונית במחקר פיזיולוגיה ריאתית. מערכת זלוף הריאות המבודדת מציעה מידה רבה של רב-תכליתיות בשימושיה ומאפשרת הערכה של מספר פרמטרים רלוונטיים בבדיקת מגוון רחב של השערות15. מערכת ריאות מבודדת היא כלי בעל נוכחות כלל עולמית…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים מבקשים להודות לדוקטורט בטינה זומר סרוונטס על תמיכתה בכתיבת כתב היד הזה, וקיציה אלנה לארה ספונט על תמיכתה באיורים.
Materials
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
Referenzen
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
- Alquicira-Mireles, J. . Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. . Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE) Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021)
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
