Изолированная система перфузии легких в модели кролика
Summary
Изолированный препарат для легких кролика является золотым стандартом в исследованиях легких. Эта публикация направлена на описание методики, разработанной для изучения физиологических и патологических механизмов, участвующих в реактивности дыхательных путей, сохранении легких и доклинических исследованиях при трансплантации легких и отеке легких.
Abstract
Изолированная система перфузии легких широко используется в легочных исследованиях, способствуя выяснению внутренней работы легких, как микро- и макроскопически. Этот метод полезен при характеристике физиологии и патологии легких путем измерения метаболической активности и дыхательных функций, включая взаимодействия между циркулирующими веществами и эффекты вдыхаемых или перфузированных веществ, как при тестировании на наркотики. В то время как методы in vitro включают нарезку и культивирование тканей, изолированная система перфузии легких ex vivo позволяет работать с полным функциональным органом, что делает возможным изучение непрерывной физиологической функции при воссоздании вентиляции и перфузии. Однако следует отметить, что последствия отсутствия центральной иннервации и лимфодренажа еще предстоит полностью оценить. Этот протокол направлен на описание сборки изолированного аппарата легких с последующим хирургическим извлечением и канюляцией легких и сердца у экспериментальных лабораторных животных, а также на отображение метода перфузии и обработки сигналов данных. Средняя жизнеспособность изолированного легкого колеблется в пределах 5-8 ч; в этот период повышается проницаемость легочных капилляров, вызывая отек и травмирование легких. Функциональность сохраненной легочной ткани измеряется коэффициентом капиллярной фильтрации (Kfc), используемым для определения степени отека легких во времени.
Introduction
Броди и Диксон впервые описали систему перфузии легких ex-vivo в 1903 году 1. С тех пор он стал золотым стандартом для изучения физиологии, фармакологии, токсикологии и биохимии легких2,3. Метод предлагает последовательный и воспроизводимый способ оценки жизнеспособности трансплантации легких и определения эффекта воспалительных медиаторов, таких как гистамин, метаболиты арахидоновой кислоты и вещество P, среди прочих, а также их взаимодействия во время легочных явлений, таких как бронхоконстрикция, ателектаз и отек легких. Изолированная система легких была ключевым методом в раскрытии важной роли легких в устранении биогенных аминов из общего кровообращения4,5. Кроме того, система была использована для оценки биохимии легочного поверхностно-активного вещества6. За последние несколько десятилетий система перфузии легких ex-vivo стала идеальной платформой для исследований трансплантации легких7. В 2001 году команда во главе со Стигом Стином описала первое клиническое применение системы перфузии легких ex-vivo, используя ее для восстановления легких 19-летнего донора, который был первоначально отвергнут центрами трансплантации из-за его травм. Левое легкое собирали и перфузировали в течение 65 мин; после этого он был успешно пересажен 70-летнему мужчине с ХОБЛ8. Дальнейшие исследования по восстановлению легких с использованием перфузии ex-vivo привели к разработке метода Торонто для расширенной перфузии легких для оценки и лечения поврежденных донорских легких9,10. Клинически система перфузии легких ex-vivo показала, что является безопасной стратегией увеличения донорских пулов путем лечения и восстановления нестандартных донорских легких, не представляя существенной разницы в рисках или исходах по сравнению со стандартными критериями доноров10.
Основным преимуществом изолированной системы перфузии легких является то, что экспериментальные параметры могут быть оценены в полном функциональном органе, который сохраняет свою физиологическую функцию при искусственной лабораторной установке. Кроме того, он позволяет измерять и манипулировать легочной механической вентиляцией для анализа компонентов легочной физиологии, таких как сопротивление дыхательных путей, общее сосудистое сопротивление, газообмен и образование отеков, которые на сегодняшний день не могут быть измерены точно in vivo на лабораторных животных2. Примечательно, что состав раствора, с помощью которого перфузируется легкое, можно полностью контролировать, что позволяет добавлять вещества для оценки их воздействия в режиме реального времени и сбора проб из перфузии для дальнейшего изучения11. Исследователи, работающие с изолированной системой легких, должны иметь в виду, что механическая вентиляция вызывает распад легочной ткани, сокращая ее полезное время. Это прогрессирующее падение механических параметров может быть значительно замедлено гиперинфляцией легких время от времени во время эксперимента4. Тем не менее, подготовка обычно не может длиться более восьми часов. Другим соображением для системы перфузии легких ex-vivo является отсутствие центральной нервной регуляции и лимфодренажа. Последствия их отсутствия еще не полностью поняты и потенциально могут быть источником предвзятости в некоторых экспериментах.
Метод изолированной перфузионной системы легких может быть выполнен в модели кролика с высокой степенью консистенции и воспроизводимости. В этой работе описываются технические и хирургические процедуры для реализации метода изолированной перфузии легких ex-vivo , разработанного для модели кролика в Национальном институте респираторных заболеваний в Мехико, с намерением поделиться идеями и предоставить четкое руководство по ключевым шагам в применении этой экспериментальной модели.
Protocol
Representative Results
Discussion
Эта работа отображает общий взгляд на изолированную систему перфузии легких, необходимую технику в исследованиях физиологии легких. Изолированная система перфузии легких предлагает большую степень универсальности в ее использовании и позволяет оценить несколько параметров, имеющи?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы хотели бы поблагодарить доктора философии Беттину Зоммер Сервантес за ее поддержку в написании этой рукописи и Китцию Елену Лару Сафонт за ее поддержку с иллюстрациями.
Materials
| 2-Stop Tygon E-Lab Tubing, 3.17 mm ID, 12/pack, Black/White | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1864 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Adapter for Positive Pressure Ventilation on IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4312 | |
| Alternative Pressure-Free Gas Supply for IPL-4: To supply the trachea with gas mixture different from room air during negative ventilation | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4309 | |
| Base Unit for the Rabbit to Fetal Pig Isolated Perfused Lung | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4138 | |
| Bovine serum A2:D41albumin lyophilized powder | sigma | 3912 | 500 g |
| Calcium chloride, CaCl2·2H2O. | JT Baker | 10035-04-8 | |
| Cryogenic vials | Corning | 430659 | 2 mL |
| D-glucosa, C6H12O6. | sigma | G5767 | |
| Differential Low Pressure Transducer DLP2.5, Range +- 2.5 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-3882 | |
| Differential Pressure Transducer MPX, Range +- 100 cmH2O, HSE Connector | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0064 | |
| Eppendorf tubes | |||
| Ethanol absolute HPLC grade | Caledon | ||
| Falcon tubes | 14 mL | ||
| Harvard Peristaltic Pump P-230 (Complete with Control Box and P-230 Motor Drive) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 70-7001 | |
| Heated Linear Pneumotachometer 0 to 10 L/min flow range | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9349 | |
| Heater Controller for Single Pneumotachometer 230 VAC, 50 Hz | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 59-9703 | |
| Heparin | PISA | 5000 UI | |
| HPLC Column (C18 100A 5U) | Alltech | 98121213 | 150 mm x 4.6 mm |
| Hydrophilic Syringe Filter | Millex | SLLGR04NL | 4 mm |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| IPL-4 Core System for Isolated Rabbit to Fetal Pig Lung, 230 V | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4296 | |
| Jacketed Glass Reservoir for Buffer Solution, with Frit and Tubing, 6.0 L | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0322 | |
| Lauda Thermostatic Circulator, Type E-103, 230 V/50 Hz, 3 L Bath Volume, Temperature Range 20 to 150°C | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0125 | |
| Left Atrium Cannula for Rabbit with Basket, OD 5.9 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4162 | |
| Low Range Blood Pressure Transducer P75 for PLUGSYS Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0020 | |
| Magnesium sulfate heptahydrate, MgSO4·7H2O | JT Baker | 10034-99-8 | |
| Microcentrifuge Tube | Corning | 430909 | |
| Negative Pressure Ventilation Control Option with Pressure Regulator for IPL-4 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4298 | |
| New Zeland rabbits | |||
| PISABENTAL (Pentobarbital sodium) | PISA | Q-7833-215 | |
| PLUGSYS Case, Type 603* 7 | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0045 | |
| PLUGSYS TCM Time Counter Module | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1750 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-A) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-0065 | |
| PLUGSYS Transducer Amplifier Module (TAM-D) | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1793 | |
| PLUGSYS VCM-4R Ventilation Control Module with Pressure Regulator | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-1755 | |
| Potassium chloride, KCl. | JT Baker | 3040-01 | |
| Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4 | JT Baker | 7778-77-0 | |
| PROCIN (Xylacine clorhydrate) | PISA | Q-7833-099 | |
| Pulmonary Artery Cannula for Rabbit with Basket, OD 4.6 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4161 | |
| Scalpel knife | |||
| Serotonin 5-HT | |||
| Servo Controller for Perfusion (SCP | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-2806 | |
| Snap Cap Microcentrifuge Tube | Costar | 3620 | 1.7 mL |
| Sodium bicarbonate, NaHCO3 | sigma | S6014 | |
| Sodium chloride, NaCl. | sigma | S9888 | |
| Surgical gloves No. 7 1/2 | |||
| Surgical gloves No. 8 | |||
| Taygon tubes | Masterflex | ||
| Tracheal Cannula for Rabbit, OD 5.0 mm | Hugo Sachs Elektronik (HSE) | 73-4163 |
Referenzen
- Dixon, W. E. Contributions to the physiology of the lungs: Part I. The bronchial muscles, their innervation, and the action of drugs upon them. The Journal of Physiology. 29 (2), 97-173 (1903).
- Nelson, K., et al. Animal models of ex vivo lung perfusion as a platform for transplantation research. World Journal of Experimental Medicine. 4 (2), 7-15 (2014).
- Roman, M. A., Nair, S., Tsui, S., Dunning, J., Parmar, J. S. Ex vivo lung perfusion: a comprehensive review of the development and exploration of future trends. Transplantation. 96 (6), 509-518 (2013).
- Delaunois, A., Gustin, P., Ansay, M. Multiple muscarinic receptor subtypes mediating pulmonary oedema in the rabbit. Pulmonary Pharmacology. 7 (3), 185-193 (1994).
- Delaunois, A., Gustin, P., Vargas, M., Ansay, M. Protective effect of various antagonists of inflammatory mediators against paraoxon-induced pulmonary edema in the rabbit. Toxicology and Applied Pharmacology. 132 (2), 343-345 (1995).
- Barr, H. A., Nicholas, T. E., Power, J. H. Control of alveolar surfactant in rats at rest and during prolonged hyperpnoea: pharmacological evidence for two tissue pools of surfactant. British Journal of Pharmacology. 93 (3), 473-482 (1988).
- Machuca, T. N., Cypel, M. Ex vivo lung perfusion. Journal of Thoracic Disease. 6 (8), 1054-1062 (2014).
- Steen, S., et al. First human transplantation of a nonacceptable donor lung after reconditioning ex vivo. The Annals of Thoracic Surgery. 83 (6), 2191-2194 (2007).
- Cypel, M., et al. Technique for prolonged normothermic ex vivo lung perfusion. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 27 (12), 1319-1325 (2008).
- Cypel, M., et al. Normothermic ex vivo lung perfusion in clinical lung transplantation. New England Journal of Medicine. 364 (15), 1431-1440 (2011).
- Kao, C. C., Parulekar, A. D. Is perfusate exchange during. Annals of Translational Medicine. 8 (3), 43 (2020).
- Alquicira-Mireles, J. . Participación de la serotonina en los cambios de permeabilidad vascular en la preservación pulmonar en conejo. , (2013).
- Arreola-Ramírez, J. L. . Papel de la liberación de acetilcolina y sustancia P en el deterioro de la función pulmonar en un modelo experimental de preservación pulmonar en conejo. , (2009).
- Isolated lung perfusion systems for small to large animal models. Harvard Apparatus. Hugo Sachs Elektronik (HSE) Available from: https://www.harvardapparatus.com/media/harvard/pdf/Isolated%20Lung%20Perfusion%20Systems%20Brochure.pdf (2021)
- Jiao, G. Evolving trend of EVLP: Advancements and emerging pathways. SN Comprehensive Clinical Medicine. 1 (4), 287-303 (2019).
- Mordant, P., et al. Mesenchymal stem cell treatment is associated with decreased perfusate concentration of interleukin-8 during ex vivo perfusion of donor lungs after 18-hour preservation. The Journal of Heart and Lung Transplantation: The Official Publication of the International Society for Heart and Lung Transplantation. 35 (10), 1245-1254 (2016).
- Cowan, P. J., Hawthorne, W. J., Nottle, M. B. Xenogeneic transplantation and tolerance in the era of CRISPR-Cas9. Current Opinion in Organ Transplantation. 24 (1), 5-11 (2019).
- Collaborators, G. C. R. D. Prevalence and attributable health burden of chronic respiratory diseases, 1990-2017: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 2017. The Lancet Respiratory Medicine. 8 (6), 585-596 (2020).
- Bravo-Reyna, C. C., Torres-Villalobos, G., Aguilar-Blas, N., Frías-Guillén, J., Guerra-Mora, J. R. Comparative study of capillary filtration coefficient (Kfc) determination by a manual and automatic perfusion system. Step by step technique review. Physiological Research. 68 (6), 901-908 (2019).
- Pereira, M. R., et al. COVID-19 in solid organ transplant recipients: Initial report from the US epicenter. American Journal of Transplantation. 20 (7), 1800-1808 (2020).
