세균 세포 없는 Lysate의 신속하고 저렴하며 단순한 생산
Summary
이 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 세균성 용해를 생성하는 신속하고 간단한 방법을 설명하며, 대장균의 엔지니어링 된 균주를 사용하고 표준 실험실 장비만 필요합니다.
Abstract
세포 없는 유전자 발현은 살아있는 유기체의 합병증 없이 생물학의 힘을 제공합니다. 많은 이러한 유전자 발현 시스템이 존재하지만, 대부분은 구매 및 / 또는 효과적으로 생산하기 위해 특수 장비와 미세하게 연마 전문 지식이 필요합니다 매우 비싸다. 이 프로토콜은 표준 실험실 장비만을 사용하고 최소한의 처리를 요구하는 높은 수준의 유전자 발현을 지원하는 세균세포 없는 용액을 생산하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 성장에 영향을 미치지 않는 내성용균을 생성하는 대장균 균주를 사용하지만, 간단한 동결 해동 사이클에 따라 수확된 세포 펠릿을 효율적으로 리스합니다. 필요한 유일한 추가 처리는 세포 파편의 자동 lylysate를 취소하는 원심 분리 다음 간단한 인큐베이션입니다. 동적 유전자 회로는 수확하기 전에 세포에서 ClpX protease의 이종 발현을 통해 달성될 수 있다. lacZ 유전자가 결여된 대장균 균주는 착색 또는 형광 판독을 사용하여 고감도, 세포 없는 생체 감지 애플리케이션에 사용될 수 있다. 전체 프로토콜은 8-9시간 만큼 필요하며, 접종부터 완료까지 1-2시간의 실습 노동만 필요합니다. 세포 없는 용액을 얻기 위한 비용과 시간을 줄임으로써, 이 방법은 다양한 응용에 대한 세포 없는 유전자 발현의 경제성을 높여야 한다.
Introduction
세포없는 용해에서의 유전자 발현은 살아있는 세포1,2,3,4를사용하는 데 비해 몇 가지 장점이 있다. Lysates는 쉽게 생화학적으로 변형될 수 있고 살아있는 세포에서 달성하기 위하여 해롭거나 불가능할 수 있는 조건에서 이용될 수 있습니다. 유전자 발현 회로는 호스트 생물학 프로세스와 경쟁하거나 경쟁할 필요가 없으며, 새로운 유전 회로를 테스트하는 것은 DNA를 추가하는 것과 같이 간단합니다. 이러한 이유로, 세포없는 유전자 발현은 바이오 센서5,6에서 합성 유전자 회로7,8을 인공 세포 개발에 빠르게 프로토타이핑하는 것까지 다양한 응용 을발견했다. 대부분의 세포 없는 유전자 발현은 고도로 처리된 세포 용액을 이용하며, 일반적으로 길고 복잡한 프로토콜, 특수 장비 및/또는 민감한 단계를 요구하여 사용자와 배치10,11사이에 상당한 변화를 초래할 수 있다.
본 백서는 최소한의 처리 및 전문 지식이 필요한 세포 없는 용액을 제조하기 위한 간단하고 효율적인 방법을설명한다(그림 1A)12. 이 방법은 간단한 동결 해동 주기에 따라 lyse하도록 설계된 대장균 세포에 의존합니다. 세포는 세포 벽을 저하파 람다에서 endolysin을 표현합니다. 세포가 성장함에 따라, 이 내용신은 세포벽에서 격리된 세포질에 남아 있습니다. 그러나, 간단한 동결 해동 주기는 세포질 막을 방해하고, 세포벽을 저하시키는 주변으로 내실신을 풀어, 급속한 세포 용해의 결과로. 프로토콜은 몇 시간 동안 실습작업으로 완료할 수 있으며 30,000g의 × 수 있는 원심분리기(최적의 결과를 위해; 더 낮은 속도)만 필요하며, 더 낮은 속도는 펠릿을 방해하지 않도록 더 많은 주의를 기울여 사용할 수 있으며, 소용돌이 믹서 및 간단한 버퍼 솔루션이 필요합니다. 기능성 용액은 세포를 동결 건조시키고 현장에서재수화하여 생산될 수도 있습니다. 그러나,이 방법은 낮은 활성으로 lysates를 생성, 아마도 나머지 세포 파편으로 인해.
용액은 세포 없는 유전자 발현을 위해 높게 활동적이며, 최종 사용에 따라 다양한 방법으로 향상될 수 있다. 단백질 합성의 속도는 표준 스핀 농축기사용으로 용액을 집중시킴으로써 더욱 증가할 수 있다. 선형 DNA는 정제된 GamS 단백질을 첨가하여 분해로부터 보호될 수 있습니다. 진동과 같은 더 복잡한 회로 역학에 필요한 단백질 분해는 자동 분해 생성균주(13)에서ClpX hexamer를 공동 발현함으로써 달성될 수 있다. 마지막으로 LacZ 기반 의 시각적 판독은 lacZ가부족한 자동 리세이트 스트레인을 사용하여 활성화됩니다. 전반적으로,이 방법은 응용 프로그램의 넓은 범위에 적합한 고도로 활성 세포 없는 용액을 생성합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기서 설명된 프로토콜은 세포 없는 유전자 발현을 위한 고활성 세균용 용액 용액을 산출한다. 핵심은 람다 파지 내질심을 세포화로 표현하는 플라스미드 pAD-LyseR을 운반하는 세포를 사용하는 것입니다. 이 세포는 내부 막의 투과화시 스스로 를 용해하기 위해 강력하게, 세포 벽에 내달리신 접근을 허용, 이는 방법은 간단한 동결 해동 주기를 통해 달성. 세포가 효과적으로 자신을 lyse 하기 때문?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자는 재커리 선과 리처드 머레이 (캘리포니아 공과 대학)에게 플라스미드 P_araBAD-gamS를 친절하게 제공한 것에 대해 감사하고, 카메이 가에코(교토 공과대학)는 고속 냉각 원심분리기를 친절하게 제공합니다. 이 작품은 국립 보건원과 ARO MURI 프로그램의 보조금에 의해 지원되었으며, 일본 MEXT 우수 젊은 연구자(MEXT)를 위한 선도적인 이니셔티브에 의해 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
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