Produção rápida, acessível e descomplicada de lysate sem células bacterianas
Summary
Este protocolo descreve um método rápido e simples para produzir lisenato bacteriano para expressão genética livre de células, usando uma cepa projetada de Escherichia coli e exigindo apenas equipamentos de laboratório padrão.
Abstract
A expressão genética livre de células oferece o poder da biologia sem as complicações de um organismo vivo. Embora existam muitos desses sistemas de expressão genética, a maioria é bastante cara para comprar e/ou requer equipamentos especiais e experiência finamente aprimorada para produzir efetivamente. Este protocolo descreve um método para produzir lisesato bacteriano livre de células que suporta altos níveis de expressão genética, utilizando apenas equipamentos de laboratório padrão e exigindo processamento mínimo. O método utiliza uma cepa Escherichia coli produzindo uma endolise que não afeta o crescimento, mas que lises eficientemente uma pelota celular colhida após um simples ciclo de congelamento. O único processamento adicional necessário é uma breve incubação seguida de centrifugação para limpar o autolise de detritos celulares. Circuitos genéticos dinâmicos podem ser alcançados através da expressão heteróloga da protease ClpX nas células antes da colheita. Uma cepa de E. coli sem o gene lacZ pode ser usada para aplicações de biossensão de alta sensibilidade e livre de células usando uma leitura colorimétrica ou fluorescente. Todo o protocolo requer apenas 8-9 horas, com apenas 1-2 horas de trabalho prático desde a inoculação até a conclusão. Ao reduzir o custo e o tempo para obter o lise livre de células, este método deve aumentar a acessibilidade da expressão genética livre de células para várias aplicações.
Introduction
A expressão genética em lises livres de células tem várias vantagens sobre o uso de células vivas1,2,3,4. Os lysatos podem ser facilmente modificados bioquimicamente e usados em condições que podem ser prejudiciais ou impossíveis de alcançar em células vivas. Circuitos de expressão genética não têm que lutar ou competir com processos biológicos hospedeiros, e testar novos circuitos genéticos é tão simples quanto adicionar DNA. Por essas razões, a expressão genética livre de células encontrou várias aplicações, desde biosensores5,6 até a rápida prototipagem de circuitos genéticos sintéticos7,8 até o desenvolvimento de células artificiais9. A maioria da expressão genética livre de células utiliza lises celulares altamente processadas, geralmente exigindo protocolos longos e complexos, equipamentos especializados e/ou etapas sensíveis que podem levar a variações significativas entre usuários e lotes10,11.
Este artigo descreve um método simples e eficiente para produzir lysate livre de células que requer processamento e experiência mínimos(Figura 1A)12. O método conta com células E. coli que são projetadas para lise após um simples ciclo de congelamento. As células expressam uma endolise de lambda de phage que degrada a parede celular. À medida que as células crescem, essa endolise permanece no citoplasma, sequestrado da parede celular. No entanto, um simples ciclo de congelamento interrompe a membrana citoplasmática, liberando a endolise no periplasma, onde degrada a parede celular, resultando em rápida lise celular. O protocolo pode ser concluído com apenas algumas horas de trabalho prático e requer apenas um freezer, uma centrífuga capaz de 30.000 × g (para resultados ideais; velocidades mais baixas podem ser usadas com mais cuidado para não perturbar a pelota), uma batedeira de vórtice e uma solução tampão simples. O lisete funcional pode até ser produzido secando as células e reidratação-as in situ. No entanto, este método produz lises com menor atividade, presumivelmente devido aos detritos celulares restantes.
Os lises são altamente ativos para a expressão genética livre de células, e podem ser aprimorados de várias maneiras, dependendo do uso final. A taxa de síntese proteica pode ser aumentada concentrando o liseto usando concentradores de spin padrão. O DNA linear pode ser protegido da degradação adicionando proteína GamS purificada. A degradação proteica, necessária para dinâmicas de circuitos mais complexas, como a oscilação, pode ser alcançada co-expressando um hexamer ClpX na cepa produtora de auto-lysato13. Finalmente, as leituras visuais baseadas em LacZ são habilitadas usando uma cepa de massa automática sem lacZ. No geral, este método produz um lysate altamente ativo livre de células que é adequado para uma ampla gama de aplicações.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo descrito aqui produz lisesto bacteriano altamente ativo para a expressão genética livre de células. A chave é usar células que carregam o plasmídeo pAD-LyseR, que expressa a lambda phage endolysin citosolicamente. Essas células são potencializados para se desobrilarem após a permeabilização da membrana interna, permitindo o acesso da endolise à parede celular, que o método consegue através de um simples ciclo de congelamento. Como as células se lisem efetivamente, o produto é referido como aut…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem zachary Sun e Richard Murray (Instituto de Tecnologia da Califórnia) por fornecer gentilmente o plasmídeo P_araBAD-gamS, e Kaeko Kamei (Instituto de Tecnologia de Kyoto) por gentilmente fornecer uma centrífuga de resfriamento de alta velocidade. Este trabalho foi apoiado por subsídios dos Institutos Nacionais de Saúde e do programa ARO MURI e foi parcialmente apoiado pela Iniciativa Líder para Excelentes Jovens Pesquisadores, MEXT, Japão.
Materials
| 2xYT media | EMD Millipore | 4.85008 | or equivalent |
| 3-PGA | Sigma Aldrich | P8877 | or equivalent |
| Amicon Ultra-15 centrifugal filter unit, 3 kDa cutoff | Millipore Sigma | UFC900308 | optional, can be used to concentrate lysate, select concentrator capacity appropriate for the volume to be concentrated |
| ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | or carbenicillin, a more stable variant |
| ATP | Sigma Aldrich | A8937 | or equivalent |
| cAMP | Sigma Aldrich | A9501 | or equivalent |
| CoA | Sigma Aldrich | C4282 | or equivalent |
| CTP | United States Biosciences | 14121 | or equivalent |
| D-glucose (dextrose) | Fisher Scientific | AAA1749603 | or equivalent |
| dithiothreitol (DTT) | Sigma Aldrich | D0632-1G | or equivalent |
| E. coli BL21-Gold (DE3) carrying pAD-LyseR | Addgene | 99244 | |
| E. coli BL21-Gold (DE3) ΔlacZ carrying pAD-LyseR | Addgene | 99245 | |
| Folinic acid | Sigma Aldrich | F7878 | or equivalent |
| GTP | United States Biosciences | 16800 | or equivalent |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375-25G | or equivalent |
| LB media | Fisher Scientific | DF0446075 | or equivalent |
| magnesium glutamate | Sigma Aldrich | 49605-250G | or equivalent |
| NAD | Sigma Aldrich | N6522 | or equivalent |
| potassium glutamate | Sigma Aldrich | G1501-100G | or equivalent |
| potassium hydroxide (KOH) | Sigma Aldrich | 221473-25G | for adjusting pH |
| potassium phosphate dibasic | Fisher Scientific | BP363-500 | or equivalent |
| potassium phosphate monobasic | Fisher Scientific | BP362-500 | or equivalent |
| Spermidine | Sigma Aldrich | 85558 | or equivalent |
| Tris-HCl | Fisher Scientific | 9310500GM | or equivalent |
| tRNA mix | Roche | 10109541001 | or equivalent |
| UTP | United States Biosciences | 23160 | or equivalent |
Referenzen
- Dudley, Q. M., Karim, A. S., Jewett, M. C. Cell-free metabolic engineering: biomanufacturing beyond the cell. Biotechnology Journal. 10 (1), 69-82 (2015).
- Smith, M. T., Wilding, K. M., Hunt, J. M., Bennett, A. M., Bundy, B. C. The emerging age of cell-free synthetic biology. FEBS Letters. 588 (17), 2755-2761 (2014).
- Casteleijn, M. G., Urtti, A., Sarkhel, S. Expression without boundaries: cell-free protein synthesis in pharmaceutical research. International Journal of Pharmaceutics. 440 (1), 39-47 (2013).
- He, M. Cell-free protein synthesis: applications in proteomics and biotechnology. New Biotechnology. 25 (2-3), 126-132 (2008).
- Pardee, K., et al. Paper-based synthetic gene networks. Cell. 159 (4), 940-954 (2014).
- Pardee, K., et al. low-cost detection of Zika virus using programmable biomolecular components. Cell. 165 (5), 1255-1266 (2016).
- Takahashi, M. K., et al. Characterizing and prototyping genetic networks with cell-free transcription-translation reactions. Methods. 86, 60-72 (2015).
- Siegal-Gaskins, D., Tuza, Z. A., Kim, J., Noireaux, V., Murray, R. M. Gene circuit performance characterization and resource usage in a cell-free “breadboard”. ACS Synthetic Biology. 3 (6), 416-425 (2014).
- Niederholtmeyer, H., Chaggan, C., Devaraj, N. K. Communication and quorum sensing in non-living mimics of eukaryotic cells. Nature Communications. 9, 5027 (2018).
- Sun, Z. Z., et al. Protocols for implementing an Escherichia coli based TX-TL cell-free expression system for synthetic biology. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (79), e50762 (2013).
- Dopp, J., Jo, Y., Reuel, N. Methods to reduce variability in E. coli-based cell-free protein expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 4 (4), 204-211 (2019).
- Didovyk, A., Tonooka, T., Tsimring, L., Hasty, J. Rapid and scalable preparation of bacterial lysates for cell-free gene expression. ACS Synthetic Biology. 6 (12), 2198-2208 (2017).
- Tonooka, T., Niederholtmeyer, H., Tsimring, L., Hasty, J. Artificial cell on a chip integrated with protein degradation. 2019 IEEE 32nd International Conference on Micro Electro Mechanical Systems (MEMS). , 107-109 (2019).
- Garibaldi, B., et al. Validation of autoclave protocols for successful decontamination of category A medical waste generated from care of patients with serious communicable diseases. Journal of Clinical Microbiology. 55 (2), 545-551 (2017).
- Cole, S., Miklos, A., Chiao, A., Sun, Z., Lux, M. Methodologies for preparation of prokaryotic extracts for cell-free expression systems. Synthetic and Systems Biotechnology. 5 (4), 252-267 (2020).
- Fujiwara, K., Doi, N. Biochemical preparation of cell extract for cell-free protein synthesis without physical disruption. PLoS ONE. 11 (4), 0154614 (2016).
- Shin, J., Noireaux, V. Efficient cell-free expression with the endogenous E. coli RNA polymerase and sigma factor 70. Journal of Biological Engineering. 4, 8 (2010).
