Neste trabalho, descrevemos um protocolo modificado para testar o flux de substrato respiratório mitocondrial usando perfringolysina recombinante O em combinação com respirometria à base de microplato. Com este protocolo, mostramos como a metformina afeta a respiração mitocondrial de duas linhas diferentes de células tumorais.
O flux de substrato mitocondrial é uma característica distintiva de cada tipo de célula, e mudanças em seus componentes como transportadores, canais ou enzimas estão envolvidas na patogênese de várias doenças. Flux de substrato mitocondrial pode ser estudado usando células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas. Investigar células intactas encontra vários problemas devido à oxidação simultânea de diferentes substratos. Além disso, vários tipos de células contêm lojas internas de diferentes substratos que complicam a interpretação dos resultados. Métodos como isolamento mitocondrial ou uso de agentes permeabilizantes não são facilmente reprodutíveis. Isolar mitocôndrias puras com membranas intactas em quantidades suficientes de pequenas amostras é problemático. O uso de permeabilizers não seletivos causa vários graus de danos inevitáveis da membrana mitocondrial. A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um permeabilizer mais apropriado, graças à sua capacidade de permeabilize seletivamente a membrana plasmática sem afetar a integridade mitocondrial. Quando usado em combinação com respirometria de microplaco, permite testar o fluxo de vários substratos mitocondriais com réplicas suficientes dentro de um experimento enquanto usa um número mínimo de células. Neste trabalho, o protocolo descreve um método para comparar o flux de substrato mitocondrial de dois fenótipos ou genótipos celulares diferentes e pode ser personalizado para testar vários substratos mitocondriais ou inibidores.
A respirometria baseada em microplacar revolucionou a pesquisa mitocondrial, permitindo o estudo da respiração celular de um pequeno tamanho amostral1. A respiração celular é geralmente considerada como um indicador de função mitocondrial ou “disfunção”, apesar do fato de que a gama mitocondrial de funções se estende além da produção de energia2. Em condições aeróbicas, as mitocôndrias extraem a energia armazenada em diferentes substratos, quebrando e convertendo esses substratos em intermediários metabólicos que podem alimentar o ciclo do ácido cítrico3 (Figura 1). O fluxo contínuo de substratos é essencial para o fluxo do ciclo do ácido cítrico gerar “doadores de elétrons” de alta energia, que fornecem elétrons para a cadeia de transporte de elétrons que gera um gradiente de prótons através da membrana mitocondrial interna, permitindo atp-synthase para fosforilato ADP para ATP4. Portanto, um projeto experimental para avaliar a respiração mitocondrial deve incluir a natureza amostral (células intactas, células permeabilizadas ou mitocôndrias isoladas) e substratos mitocondriais.
As células mantêm um estoque de substratos indígenas5, e mitocôndrias oxidam vários tipos de substratos simultaneamente6, o que complica a interpretação dos resultados obtidos a partir de experimentos realizados em células intactas. Uma abordagem comum para investigar a capacidade mitocondrial de oxidar um substrato selecionado é isolar mitocôndrias ou permeabiliizar as células investigadas5. Embora mitocôndrias isoladas sejam ideais para estudos quantitativos, o processo de isolamento é trabalhoso. Enfrenta dificuldades técnicas como a necessidade de grande tamanho amostral, pureza do rendimento e reprodutibilidade da técnica5. As células permeabilizadas oferecem uma solução para as desvantagens do isolamento mitocondrial; no entanto, os agentes de permeabilização de rotina da natureza detergente não são específicos e podem danificar as membranas mitocondriais5.
A perfringolysina recombinante O (rPFO) foi oferecida como um agente de permeabilizing de membrana plasmática seletiva7, e foi utilizada com sucesso em combinação com um analisador de fluxo extracelular em vários estudos7,8,9,10. Modificamos um protocolo usando rPFO para tela de flux de substrato mitocondrial usando o analisador de fluxo extracelular XFe96. Neste protocolo, quatro diferentes vias oxidantes de substratos em dois fenótipos celulares são comparadas, tendo réplicas suficientes e o controle adequado para cada material testado.
Este protocolo é uma modificação dos estudos publicados anteriormente7,8,9,10 e o guia do usuário do produto. Em contraste com o protocolo do fabricante, o 2x MAS é usado em vez de 3x MAS, uma vez que 2× MAS é mais fácil de dissolver e não forma precipitações após o congelamento. Alíquotas MAS 2x congeladas podem ser armazenadas até seis meses e mostrar resultados consistentes. Ou…
The authors have nothing to disclose.
Os autores agradecem aos funcionários do Departamento de Fisiologia da Faculdade de Medicina de Hradec Králové e do Departamento de Fisiopatologia da Terceira Faculdade de Medicina pela ajuda com a preparação de produtos químicos e amostras. Este trabalho foi apoiado pelos programas de bolsas da Universidade Charles PROGRES Q40/02, O Ministério da Saúde tcheco concede nu21-01-00259, a Fundação Tcheca de Ciências concede 18-10144 e o projeto INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046 financiado pelo Ministério da Educação, Juventude e Esportes da República Tcheca e pela União Europeia.
Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
Water | Merck | W3500 | store at RT |
XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |