Измерение потока митохондриального субстрата в рекомбинантных перфринголизиновых O-пермеабилизированных клетках
Summary
В этой работе мы описываем модифицированный протокол для тестирования потока митохондриального дыхательного субстрата с использованием рекомбинантного перфринголизина O в сочетании с микропластинчатой респирометрией. С помощью этого протокола мы показываем, как метформин влияет на митохондриальное дыхание двух разных линий опухолевых клеток.
Abstract
Поток митохондриального субстрата является отличительной характеристикой каждого типа клеток, и изменения в его компонентах, таких как транспортеры, каналы или ферменты, участвуют в патогенезе нескольких заболеваний. Поток митохондриального субстрата может быть изучен с использованием интактных клеток, пермеабилизированных клеток или изолированных митохондрий. Исследование интактных клеток сталкивается с несколькими проблемами из-за одновременного окисления различных субстратов. Кроме того, несколько типов клеток содержат внутренние хранилища различных субстратов, что затрудняет интерпретацию результатов. Такие методы, как изоляция митохондрий или использование пермеабилизирующих агентов, нелегко воспроизвести. Выделение чистых митохондрий с интактными мембранами в достаточном количестве из небольших образцов проблематично. Использование неселективных пермеабилизаторов вызывает различные степени неизбежного повреждения митохондриальной мембраны. Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) был предложен в качестве более подходящего пермеабилизатора, благодаря его способности избирательно проникать плазматической мембраной, не влияя на целостность митохондрий. При использовании в сочетании с микропластинчатой респирометрией он позволяет тестировать поток нескольких митохондриальных субстратов с достаточным количеством реплик в рамках одного эксперимента при использовании минимального количества клеток. В этой работе протокол описывает метод сравнения потока митохондриального субстрата двух разных клеточных фенотипов или генотипов и может быть настроен для тестирования различных митохондриальных субстратов или ингибиторов.
Introduction
Микропластичная респирометрия произвела революцию в митохондриальных исследованиях, позволив изучать клеточное дыхание небольшого размера выборки1. Клеточное дыхание обычно рассматривается как показатель митохондриальной функции или «дисфункции», несмотря на то, что диапазон функций митохондрий простирается за пределы производства энергии2. В аэробных условиях митохондрии извлекают энергию, хранящуюся в различных субстратах, разрушая и превращая эти субстраты в метаболические промежуточные продукты, которые могут подпитывать цикл лимонной кислоты3 (рисунок 1). Непрерывный поток субстратов необходим для потока цикла лимонной кислоты для генерации высокоэнергетических «доноров электронов», которые доставляют электроны в цепочку переноса электронов, которая генерирует протонный градиент через внутреннюю митохондриальную мембрану, позволяя АТФ-синтазе фосфорилировать АДФ к АТФ4. Поэтому экспериментальная конструкция для анализа митохондриального дыхания должна включать природу образца (интактные клетки, пермеабилизированные клетки или изолированные митохондрии) и митохондриальные субстраты.
Клетки хранят запас местных субстратов5,а митохондрии окисляют несколько типов субстратов одновременно6,что усложняет интерпретацию результатов, полученных в результате экспериментов, проведенных на интактных клетках. Распространенным подходом к исследованию способности митохондрий окислять выбранный субстрат является выделение митохондрий или пермеабилизация исследуемых клеток5. Хотя изолированные митохондрии идеально подходят для количественных исследований, процесс выделения трудоемкий. Он сталкивается с техническими трудностями, такими как необходимость большого размера выборки, чистота выхода и воспроизводимость метода5. Пермеабилизированные клетки предлагают решение для недостатков митохондриальной изоляции; однако обычные пермеабилизирующие агенты моющей природы не являются специфическими и могут повредить митохондриальные мембраны5.
Рекомбинантный перфринголизин O (rPFO) предлагали в качестве селективного проницателя плазматической мембраны7,и он успешно применялся в комбинации с внеклеточным анализатором флюса в нескольких исследованиях7,8,9,10. Мы модифицировали протокол с использованием rPFO для скрининга потока митохондриальной субстраты с помощью анализатора внеклеточного потока XFe96. В этом протоколе сравниваются четыре различных пути окисления субстрата в двух клеточных фенотипах, имея достаточные реплики и надлежащий контроль для каждого тестируемого материала.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данный протокол является модификацией ранее опубликованных исследований7,8,9,10 и руководства пользователя продукта. В отличие от протокола производителя, вместо 3x MAS используется 2x MAS, так как 2×x MAS легче растворяется ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы благодарят сотрудников кафедры физиологии медицинского факультета в Градце Кралове и кафедры патофизиологии третьего медицинского факультета за помощь в подготовке химических веществ и образцов. Эта работа была поддержана грантовыми программами Карлова университета PROGRES Q40/02, грантом Министерства здравоохранения Чехии NU21-01-00259, грантом Чешского научного фонда 18-10144 и проектом INOMED CZ.02.1.01/0.0/0.0/18_069/0010046, финансируемым Министерством образования, молодежи и спорта Чешской Республики и Европейским союзом.
Materials
| Adinosine 5′ -diphosphate monopotassium salt dihydrate | Merck | A5285 | store at -20 °C |
| Antimycin A | Merck | A8674 | store at -20 °C |
| Bovine serum albumin | Merck | A3803 | store at 2 – 8 °C |
| Carbonyl cyanide 4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone | Merck | C2920 | store at -20 °C |
| Dimethyl sulfoxide | Merck | D8418 | store at RT |
| D-Mannitol | Merck | 63559 | store at RT |
| Dulbecco's phosphate buffered saline | Gibco | 14190-144 | store at RT |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid | Merck | 03777 | store at RT |
| HEPES | Merck | H7523 | store at RT |
| L(-)Malic acid disodium salt | Merck | M9138 | store at RT |
| L-Glutamic acid sodium salt hydrate | Merck | G5889 | store at RT |
| Magnissium chloride hexahydrate | Merck | M2670 | store at RT |
| Oligomycin | Merck | O4876 | store at -20 °C |
| Palmitoyl-DL-carnitine chloride | Merck | P4509 | store at -20 °C |
| Potassium hydroxide | Merck | 484016 | store at RT |
| Potassium phosphate monobasic | Merck | P5655 | store at RT |
| Rotenone | Merck | R8875 | store at -20 °C |
| Seahorse Wave Desktop Software | Agilent technologies | Download from www.agilent.com | |
| Seahorse XFe96 Analyzer | Agilent technologies | ||
| Seahorse XFe96 FluxPak | Agilent technologies | 102416-100 | XFe96 sensor cartridges and XF96 cell culture microplates |
| Sodium pyruvate | Merck | P2256 | store at 2 – 8 °C |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Merck | S2378 | store at RT |
| Sucrose | Merck | S7903 | store at RT |
| Water | Merck | W3500 | store at RT |
| XF calibrant | Agilent technologies | 100840-000 | store at RT |
| XF Plasma membrane permeabilizer | Agilent technologies | 102504-100 | Recombinant perfringolysin O (rPFO) – Aliquot and store at -20 °C |
Referenzen
- Gerencser, A. A., et al. Quantitative microplate-based respirometry with correction for oxygen diffusion. Analytical Chemistry. 81 (16), 6868-6878 (2009).
- Murphy, E., et al. Mitochondrial function, biology, and role in disease: A scientific statement from the American Heart Association. Circulation Research. 118 (12), 1960-1991 (2016).
- Owen, O. E., Kalhan, S. C., Hanson, R. W. The key role of anaplerosis and cataplerosis for citric acid cycle function. Journal of Biological Chemistry. 277 (34), 30409-30412 (2002).
- Nicholls, D. G., Ferguson, S. J. . Bioenergetics 3. , (2002).
- Brand, M. D., Nicholls, D. G. Assessing mitochondrial dysfunction in cells. Biochemical Journal. 435 (2), 297-312 (2011).
- Staňková, P., et al. Adaptation of mitochondrial substrate flux in a mouse model of nonalcoholic fatty liver disease. International Journal of Molecular Sciences. 21 (3), 1101 (2020).
- Salabei, J. K., Gibb, A. A., Hill, B. G. Comprehensive measurement of respiratory activity in permeabilized cells using extracellular flux analysis. Nature Protocols. 9 (2), 421-438 (2014).
- Divakaruni, A. S., et al. Thiazolidinediones are acute, specific inhibitors of the mitochondrial pyruvate carrier. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (14), 5422-5427 (2011).
- Divakaruni, A. S., Rogers, G. W., Murphy, A. N. Measuring mitochondrial function in permeabilized cells using the seahorse XF analyzer or a Clark-type oxygen electrode. Current Protocols in Toxicology. 60, 1-16 (2014).
- Elkalaf, M., Tůma, P., Weiszenstein, M., Polák, J., Trnka, J. Mitochondrial probe Methyltriphenylphosphonium (TPMP) inhibits the Krebs cycle enzyme 2-Oxoglutarate dehydrogenase. PLoS One. 11 (8), 0161413 (2016).
- Rogers, G. W., et al. High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria. PLoS One. 6 (7), 21746 (2011).
