Оценка потребления аминокислот в культивируемых костных клетках и изолированных костных стержнях
Summary
Этот протокол представляет собой радиоактивный анализ поглощения аминокислот, который полезен для оценки потребления аминокислот либо в первичных клетках, либо в изолированных костях.
Abstract
Развитие костей и гомеостаза зависит от дифференцировки и активности костеобразующих остеобластов. Дифференцировка остеобластов последовательно характеризуется пролиферацией, за которой следует синтез белка и, в конечном счете, секреция костного матрикса. Пролиферация и синтез белка требуют постоянного поступления аминокислот. Несмотря на это, очень мало известно о потреблении аминокислот в остеобластах. Здесь мы описываем очень чувствительный протокол, который предназначен для измерения потребления аминокислот с использованием радиомаркированных аминокислот. Этот метод оптимизирован для количественной оценки изменений в поглощении аминокислот, которые связаны с пролиферацией или дифференцировкой остеобластов, медикаментозным лечением или лечением фактора роста или различными генетическими манипуляциями. Важно отметить, что этот метод может быть использован взаимозаменяемо для количественной оценки потребления аминокислот в культивируемых клеточных линиях или первичных клетках in vitro или в изолированных костных стволах ex vivo. Наконец, наш метод может быть легко адаптирован для измерения транспорта любой из аминокислот, а также глюкозы и других радиоактивных меток питательных веществ.
Introduction
Аминокислоты представляют собой органические соединения, которые содержат амино (-NH2) и карбоксильные (-COOH) функциональные группы с переменной боковой цепью, специфичной для каждой аминокислоты. В целом, аминокислоты хорошо известны как основная составляющая белка. Совсем недавно были выяснены новые применения и функции аминокислот. Например, отдельные аминокислоты могут метаболизироваться с образованием промежуточных метаболитов, которые способствуют биоэнергетике, функционируют как ферментативные кофакторы, регулируют активные формы кислорода или используются для синтеза других аминокислот 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Многие исследования показывают, что метаболизм аминокислот имеет решающее значение для плюрипотентности клеток, пролиферации и дифференцировки в различных контекстах 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Остеобласты являются секреторными клетками, которые производят и секретируют коллаген типа 1, богатый внеклеточным костным матриксом. Чтобы поддерживать высокие темпы синтеза белка во время формирования костей, остеобласты требуют постоянного предложения аминокислот. Чтобы удовлетворить этот спрос, остеобласты должны активно приобретать аминокислоты. В соответствии с этим, недавние исследования показывают важность поглощения аминокислот и метаболизма в активности остеобластов и формировании костей 15,16,17,18,19,20.
Остеобласты приобретают клеточные аминокислоты из трех основных источников: внеклеточной среды, внутриклеточной деградации белка и биосинтеза аминокислот de novo. Этот протокол будет сосредоточен на оценке поглощения аминокислот из внеклеточной среды. Наиболее распространенные методы измерения поглощения аминокислот основаны либо на радиомаркированных (например, 3H или 14C), либо на тяжелых изотопах, меченных (например, 13C) аминокислотах. Тяжелые изотопомерные анализы могут анализировать поглощение и метаболизм аминокислот более тщательно и безопасно, но занимают более много времени, чтобы завершить несколько дней, поскольку требуется день для подготовки и дериватизации образцов и несколько дней для анализа на масс-спектрометре в зависимости от количества образцов21,22. Для сравнения, радиоактивные анализы поглощения аминокислот не информативны о последующем метаболизме, но являются дешевыми и относительно быстрыми, будучи в состоянии быть завершенными в течение 2-3 ч с начала эксперимента23,24. Здесь мы описываем легко модифицируемый базовый протокол, предназначенный для оценки поглощения радиоактивными аминокислотами в культивируемых первичных клетках или клеточных линиях in vitro или отдельных костных стволах ex vivo. Применение этих двух протоколов может быть распространено на другие меченые радиоактивными аминокислотами и другими типами клеток и тканей, связанных с костями.
Protocol
Representative Results
Discussion
Протокол, описанный в настоящем описании, обеспечивает быстрый и чувствительный подход к оценке поглощения аминокислот в ответ на различные экспериментальные перестановки либо in vitro, либо ex vivo. По сравнению с коммерчески доступными наборами (например, Glutamine и Glutamate Determination Kit), ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Лаборатория Карнера поддерживается грантами Национального института здравоохранения R01 (AR076325 и AR071967) для C.M.K.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
Referenzen
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
