Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.
Kemik gelişimi ve homeostazı, kemik oluşturan osteoblastların farklılaşmasına ve aktivitesine bağlıdır. Osteoblast farklılaşması sırasıyla proliferasyon, ardından protein sentezi ve nihayetinde kemik matriksi sekresyonu ile karakterizedir. Proliferasyon ve protein sentezi, sürekli bir amino asit kaynağı gerektirir. Buna rağmen, osteoblastlarda amino asit tüketimi hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, radyoaktif etiketli amino asitleri kullanarak amino asit tüketimini ölçmek için tasarlanmış çok hassas bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, osteoblast proliferasyonu veya farklılaşması, ilaç veya büyüme faktörü tedavileri veya çeşitli genetik manipülasyonlarla ilişkili amino asit alımındaki değişiklikleri ölçmek için optimize edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem kültürlenmiş hücre hatlarında veya primer hücrelerde in vitro veya izole kemik şaftlarında ex vivo amino asit tüketimini ölçmek için birbirinin yerine kullanılabilir. Son olarak, yöntemimiz amino asitlerin herhangi birinin, glikozun ve diğer radyoaktif etiketli besin maddelerinin taşınmasını ölçmek için kolayca uyarlanabilir.
Amino asitler, her amino aside özgü değişken bir yan zincire sahip bir amino (-NH2) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel grupları içeren organik bileşiklerdir. Genel olarak, amino asitler proteinin temel bileşeni olarak iyi bilinir. Daha yakın zamanlarda, amino asitlerin yeni kullanımları ve işlevleri açıklığa kavuşturulmuştur. Örneğin, bireysel amino asitler, biyoenerjetik maddelere katkıda bulunan, enzimatik kofaktörler olarak işlev gören, reaktif oksijen türlerini düzenleyen veya diğer amino asitleri sentezlemek için kullanılan ara metabolitler üretmek için metabolize edilebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Birçok çalışma, amino asit metabolizmasının çeşitli bağlamlarda hücre pluripotensi, proliferasyonu ve farklılaşması için kritik olduğunu göstermektedir 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblastlar, Kollajen Tip 1 bakımından zengin hücre dışı kemik matriksini üreten ve salgılayan salgı hücreleridir. Kemik oluşumu sırasında yüksek oranda protein sentezini sürdürmek için, osteoblastlar sürekli bir amino asit arzı gerektirir. Bu talebi karşılamak için, osteoblastlar aktif olarak amino asitler edinmelidir. Bununla tutarlı olarak, son çalışmalar osteoblast aktivitesinde ve kemik oluşumunda amino asit alımının ve metabolizmasının önemini ortaya koymaktadır 15,16,17,18,19,20.
Osteoblastlar hücresel amino asitleri üç ana kaynaktan elde eder: hücre dışı ortam, hücre içi protein yıkımı ve de novo amino asit biyosentezi. Bu protokol, hücre dışı ortamdan amino asit alımının değerlendirilmesine odaklanacaktır. Amino asit alımını ölçmek için en yaygın yöntemler, radyoaktif etiketli (örneğin, 3H veya 14C) veya ağır izotop etiketli (örneğin, 13C) amino asitlere dayanır. Ağır izotopomer testleri, amino asit alımını ve metabolizmasını daha ayrıntılı ve güvenli bir şekilde analiz edebilir, ancak numunelerin hazırlanması ve türetilmesi bir gün sürdüğü için tamamlanması birkaç gün sürdüğü için tamamlanması daha fazla zaman alır ve numune sayısına bağlı olarak kütle spektrometresinde analiz etmek için birkaç gün sürer21,22. Buna karşılık, radyoaktif etiketli amino asit alım analizleri aşağı akış metabolizması hakkında bilgilendirici değildir, ancak ucuz ve nispeten hızlıdır, deneyin başlangıcından itibaren 2-3 saat içinde tamamlanabilir23,24. Burada, kültürlenmiş primer hücrelerde veya in vitro hücre hatlarında veya bireysel kemik şaftlarında radyoaktif işaretli amino asit alımını değerlendirmek için tasarlanmış kolayca değiştirilebilir bir temel protokolü ex vivo olarak tanımlamaktayız. Bu iki protokolün uygulanması, diğer radyoaktif etiketli amino asitlere ve diğer kemikle ilişkili hücre tiplerine ve dokularına genişletilebilir.
Burada açıklanan protokol, in vitro veya ex vivo çeşitli deneysel permütasyonlara yanıt olarak amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yaklaşım sağlar. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle (örneğin, Glutamin ve Glutamat Belirleme Kiti) karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassas, daha hızlı ve daha az emek yoğun16,17,25’tir. Protokolümüzde, Krebs Ringer…
The authors have nothing to disclose.
Karner laboratuvarı, C.M.K.’ya Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 hibeleri (AR076325 ve AR071967) tarafından desteklenmektedir.
0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
12-well plate | Corning | 3513 | |
1mL syringe | BD precision | 309628 | |
30G Needle | BD precision | 305106 | |
Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
Beckman LS6500 scintillation counter | |||
Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
choline chloride | Sigma | C7077 | |
D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
DPBS | Gibco | 14190 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
MEMα | Gibco | 12561 | |
Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
NP-40 | Sigma | 492016 | |
Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
sodium chloride | Sigma | S9888 | |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
Tris Base | Sigma | 648311 | |
Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |