Kültürlenmiş Kemik Hücrelerinde ve İzole Kemik Şaftlarında Amino Asit Tüketiminin Değerlendirilmesi
Summary
Bu protokol, birincil hücrelerde veya izole kemiklerde amino asit tüketimini değerlendirmek için yararlı olan radyoişaretli bir amino asit alım testi sunar.
Abstract
Kemik gelişimi ve homeostazı, kemik oluşturan osteoblastların farklılaşmasına ve aktivitesine bağlıdır. Osteoblast farklılaşması sırasıyla proliferasyon, ardından protein sentezi ve nihayetinde kemik matriksi sekresyonu ile karakterizedir. Proliferasyon ve protein sentezi, sürekli bir amino asit kaynağı gerektirir. Buna rağmen, osteoblastlarda amino asit tüketimi hakkında çok az şey bilinmektedir. Burada, radyoaktif etiketli amino asitleri kullanarak amino asit tüketimini ölçmek için tasarlanmış çok hassas bir protokolü açıklıyoruz. Bu yöntem, osteoblast proliferasyonu veya farklılaşması, ilaç veya büyüme faktörü tedavileri veya çeşitli genetik manipülasyonlarla ilişkili amino asit alımındaki değişiklikleri ölçmek için optimize edilmiştir. Önemli olarak, bu yöntem kültürlenmiş hücre hatlarında veya primer hücrelerde in vitro veya izole kemik şaftlarında ex vivo amino asit tüketimini ölçmek için birbirinin yerine kullanılabilir. Son olarak, yöntemimiz amino asitlerin herhangi birinin, glikozun ve diğer radyoaktif etiketli besin maddelerinin taşınmasını ölçmek için kolayca uyarlanabilir.
Introduction
Amino asitler, her amino aside özgü değişken bir yan zincire sahip bir amino (-NH2) ve karboksil (-COOH) fonksiyonel grupları içeren organik bileşiklerdir. Genel olarak, amino asitler proteinin temel bileşeni olarak iyi bilinir. Daha yakın zamanlarda, amino asitlerin yeni kullanımları ve işlevleri açıklığa kavuşturulmuştur. Örneğin, bireysel amino asitler, biyoenerjetik maddelere katkıda bulunan, enzimatik kofaktörler olarak işlev gören, reaktif oksijen türlerini düzenleyen veya diğer amino asitleri sentezlemek için kullanılan ara metabolitler üretmek için metabolize edilebilir 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Birçok çalışma, amino asit metabolizmasının çeşitli bağlamlarda hücre pluripotensi, proliferasyonu ve farklılaşması için kritik olduğunu göstermektedir 3,6,11,12,13,14,15,16,17.
Osteoblastlar, Kollajen Tip 1 bakımından zengin hücre dışı kemik matriksini üreten ve salgılayan salgı hücreleridir. Kemik oluşumu sırasında yüksek oranda protein sentezini sürdürmek için, osteoblastlar sürekli bir amino asit arzı gerektirir. Bu talebi karşılamak için, osteoblastlar aktif olarak amino asitler edinmelidir. Bununla tutarlı olarak, son çalışmalar osteoblast aktivitesinde ve kemik oluşumunda amino asit alımının ve metabolizmasının önemini ortaya koymaktadır 15,16,17,18,19,20.
Osteoblastlar hücresel amino asitleri üç ana kaynaktan elde eder: hücre dışı ortam, hücre içi protein yıkımı ve de novo amino asit biyosentezi. Bu protokol, hücre dışı ortamdan amino asit alımının değerlendirilmesine odaklanacaktır. Amino asit alımını ölçmek için en yaygın yöntemler, radyoaktif etiketli (örneğin, 3H veya 14C) veya ağır izotop etiketli (örneğin, 13C) amino asitlere dayanır. Ağır izotopomer testleri, amino asit alımını ve metabolizmasını daha ayrıntılı ve güvenli bir şekilde analiz edebilir, ancak numunelerin hazırlanması ve türetilmesi bir gün sürdüğü için tamamlanması birkaç gün sürdüğü için tamamlanması daha fazla zaman alır ve numune sayısına bağlı olarak kütle spektrometresinde analiz etmek için birkaç gün sürer21,22. Buna karşılık, radyoaktif etiketli amino asit alım analizleri aşağı akış metabolizması hakkında bilgilendirici değildir, ancak ucuz ve nispeten hızlıdır, deneyin başlangıcından itibaren 2-3 saat içinde tamamlanabilir23,24. Burada, kültürlenmiş primer hücrelerde veya in vitro hücre hatlarında veya bireysel kemik şaftlarında radyoaktif işaretli amino asit alımını değerlendirmek için tasarlanmış kolayca değiştirilebilir bir temel protokolü ex vivo olarak tanımlamaktayız. Bu iki protokolün uygulanması, diğer radyoaktif etiketli amino asitlere ve diğer kemikle ilişkili hücre tiplerine ve dokularına genişletilebilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada açıklanan protokol, in vitro veya ex vivo çeşitli deneysel permütasyonlara yanıt olarak amino asit alımını değerlendirmek için hızlı ve hassas bir yaklaşım sağlar. Ticari olarak temin edilebilen kitlerle (örneğin, Glutamin ve Glutamat Belirleme Kiti) karşılaştırıldığında, bu yöntem çok daha hassas, daha hızlı ve daha az emek yoğun16,17,25’tir. Protokolümüzde, Krebs Ringer…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Karner laboratuvarı, C.M.K.’ya Ulusal Sağlık Enstitüsü R01 hibeleri (AR076325 ve AR071967) tarafından desteklenmektedir.
Materials
| 0.25% trypsin | Gibco | 25200 | |
| 12-well plate | Corning | 3513 | |
| 1mL syringe | BD precision | 309628 | |
| 30G Needle | BD precision | 305106 | |
| Arginine Monohydrochloride L-[2,3,4-3H]-, 1mCi | PerkinElmer | NET1123001MC | |
| Beckman LS6500 scintillation counter | |||
| Calcium chloride | Sigma | C1016 | |
| choline chloride | Sigma | C7077 | |
| D-(+)-Glucose solution | Sigma | G8769 | |
| Dissection Tool | Forceps, scissors, scapels | ||
| DPBS | Gibco | 14190 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E9884 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630 | |
| L-[3,4-3H(N)]-Glutamine | PerkinElmer | NET551250UC | |
| Liquid scintilation vials | Sigma | Z190535 | |
| lithium chloride solution, 8M | Sigma | L7026 | |
| Magnesium chloride | Sigma | M8266 | |
| MEMα | Gibco | 12561 | |
| Microcentrifuge tube, 15mL | Biotix | 89511-256 | |
| NP-40 | Sigma | 492016 | |
| Potassium chloride | Sigma | P3911 | |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014 | |
| sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma | 436143 | |
| Sonicator | Sonic&Materials | VCX130 | |
| Tris Base | Sigma | 648311 | |
| Ultima Gold (Scintillation solution) | PerkinElmer | 6013329 | |
| α-(Methylamino)isobutyric acid | Sigma | M2383 |
Referenzen
- Xiao, M., et al. Inhibition of α-KG-dependent histone and DNA demethylases by fumarate and succinate that are accumulated in mutations of FH and SDH tumor suppressors. Genes & Development. 26 (12), 1326-1338 (2012).
- Altman, B. J., Stine, Z. E., Dang, C. V. From Krebs to clinic: glutamine metabolism to cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 16 (10), 619-634 (2016).
- Karner, C. M., Long, F. Wnt signaling and cellular metabolism in osteoblasts. Cell and Molecular Life Sciences. 74 (9), 1649-1657 (2017).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metabolism. 15 (4), 451-465 (2012).
- Nagano, T., et al. Proline dehydrogenase promotes senescence through the generation of reactive oxygen species. Journal of Cell Science. 130 (8), 1413-1420 (2017).
- Comes, S., et al. L-Proline induces a mesenchymal-like invasive program in embryonic stem cells by remodeling H3K9 and H3K36 methylation. Stem Cell Reports. 1 (4), 307-321 (2013).
- Fan, J., et al. Glutamine-driven oxidative phosphorylation is a major ATP source in transformed mammalian cells in both normoxia and hypoxia. Molecular Systems Biology. 9, 712 (2013).
- Hosios, A. M., et al. Amino acids rather than glucose account for the majority of cell mass in proliferating mammalian cells. Developmental Cell. 36 (5), 540-549 (2016).
- Welbourne, T. C. Ammonia production and glutamine incorporation into glutathione in the functioning rat kidney. Canadian Journal of Biochemistry. 57 (3), 233-237 (1979).
- Sullivan, L. B., et al. Supporting aspartate biosynthesis is an essential function of respiration in proliferating cells. Cell. 162 (3), 552-563 (2015).
- Nelsen, C. J., et al. Amino acids regulate hepatocyte proliferation through modulation of cyclin D1 expression. The Journal of Biological Chemistry. 278 (28), 25853-25858 (2003).
- Krall, A. S., Xu, S., Graeber, T. G., Braas, D., Christofk, H. R. Asparagine promotes cancer cell proliferation through use as an amino acid exchange factor. Nature Communications. 7, 11457 (2016).
- Green, C. R., et al. Branched-chain amino acid catabolism fuels adipocyte differentiation and lipogenesis. Nature Chemical Biology. 12 (1), 15-21 (2016).
- Shiraki, N., et al. Methionine metabolism regulates maintenance and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Metabolism. 19 (5), 780-794 (2014).
- Yu, Y., et al. Glutamine metabolism regulates proliferation and lineage allocation in skeletal stem cells. Cell Metabolism. 29 (4), 966-978 (2019).
- Shen, L., Sharma, D., Yu, Y., Long, F., Karner, C. M. Biphasic regulation of glutamine consumption by WNT during osteoblast differentiation. Journal of Cell Science. 134 (1), (2021).
- Karner, C. M., Esen, E., Okunade, A. L., Patterson, B. W., Long, F. Increased glutamine catabolism mediates bone anabolism in response to WNT signaling. Journal of Clinical Investigation. 125 (2), 551-562 (2015).
- Hu, G., et al. The amino acid sensor Eif2ak4/GCN2 is required for proliferation of osteoblast progenitors in mice. Journal of Bone and Mineral Research. 35 (10), 2004-2014 (2020).
- Rached, M. T., et al. FoxO1 is a positive regulator of bone formation by favoring protein synthesis and resistance to oxidative stress in osteoblasts. Cell Metabolism. 11 (2), 147-160 (2010).
- Elefteriou, F., et al. ATF4 mediation of NF1 functions in osteoblast reveals a nutritional basis for congenital skeletal dysplasiae. Cell Metabolism. 4 (6), 441-451 (2006).
- Maleknia, S. D., Johnson, R. Mass spectrometry of amino acids and proteins. Amino Acids, Peptides and Proteins in Organic Chemistry. , 1-50 (2011).
- Rennie, M. J. An introduction to the use of tracers in nutrition and metabolism. The Proceedings of the Nutrition Society. 58 (4), 935-944 (1999).
- Hahn, T. J., Downing, S. J., Phang, J. M. Amino acid transport in adult diaphyseal bone: contrast with amino acid transport mechanisms in fetal membranous bone. Biochimica Biophysica Acta. 183 (1), 194-203 (1969).
- Rosenbusch, J. P., Flanagan, B., Nichols, G. Active transport of amino acids into bone cells. Biochimica Biophysica Acta. 135 (4), 732-740 (1967).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
