基于面积的图像分析算法，用于巨噬细胞-成纤维细胞共生群的定量
Summary
我们提出了一种方法，该方法利用可推广的基于区域的图像分析方法来识别细胞计数。对不同细胞群的分析利用了自适应算法中不同细胞类型之间显着的细胞高度和结构差异。
Abstract
细胞定量对于广泛的生物学和生化研究是必要的。传统的细胞图像分析通常采用荧光检测方法，例如免疫荧光染色或使用荧光蛋白或边缘检测技术转染，由于图像背景中的噪声和其他非理想性，这些方法通常容易出错。
我们设计了一种新算法，可以准确地计数和区分巨噬细胞和成纤维细胞，这些巨噬细胞和成纤维细胞是不同表型的细胞，通常在组织再生过程中共定位。MATLAB用于实现该算法，该算法根据背景的高度差异来区分不同的细胞类型。使用基于面积的方法开发了一种主要算法，以考虑细胞大小/结构和高密度接种条件的变化。
利用内部参数（例如使用给定细胞类型的实验数据计算的细胞覆盖率）的二次迭代算法来解释细胞结构中的非理想性。最后，采用分离算法对共生环境进行分析，该算法根据对图像内相对高度差异的评估，选择性地排除了各种细胞类型。发现这种方法可以准确计数单培养细胞的5%误差范围内的细胞，以及共培养细胞的10%误差范围内的细胞。
Introduction
在图像分析技术过程中定期实施软件，以确保结果是准确，高效和无偏的。对于基于细胞的检测，一个常见的问题是细胞的错误识别。具有不正确的焦距和对比度设置的图像可能导致细胞模糊，其中单个细胞的边界变得难以识别1。存在无关的图像特征（如毛孔、气泡或其他不需要的物体）会减慢计数过程并导致错误识别，从而妨碍计数过程。此外，细胞计数可能很繁重，并且计数数百个重复可能非常耗时。此外，在手动计数过程中存在固有的主观偏见，因此有关细胞鉴定的决策通常不准确2。自动化软件提供了令人兴奋的潜力，通过快速准确地将细胞与无关的物体区分开来，包括远远超出人类精确检测能力的物体，基于明确定义的识别标准，减少研究者偏见的影响，从而绕过所有这些问题。使用自动化软件识别细胞的常用技术涉及两种主要方法：分割和阈值3。在本文中，我们展示了一种可推广的基于区域的方案，该协议可在广泛访问的软件框架内实现快速，准确和廉价的细胞计数。
分割技术，如边缘检测，试图通过利用图像中的强度差异来分离单个细胞。将细胞与图像其余部分区分开来的强度变化通常由亮度的急剧变化组成4.边缘检测涉及正则滤波步骤，然后是检测强度变化的微分步骤。分化过程识别高强度变化图像中的边缘和轮廓，这些边缘和轮廓与细胞存在相关。虽然有噪声的图像可以通过去噪算法4运行，但边缘检测技术非常适合用于分析低背景噪声的图像。当细胞边界清晰易辨，并且不受与细胞存在、细胞模糊、无关物体或定义的内部细胞结构1，2无关的亮度轮廓的阻碍时，该过程将发挥最佳功能。如果图像特别嘈杂，则可以通过荧光染色或用荧光蛋白转染2，5进一步区分细胞。虽然这显着提高了分割技术的准确性，但它需要额外的成本和额外的时间投资来制备用于成像的细胞培养物。
阈值技术涉及将图像分为两类：前景和背景，单元格分配给前景3。这些技术利用颜色/对比度变化来定义物体的表观高度;通常比背景“高”的对象可以很容易地识别为单元格。分水岭变换通过关联以浅色像素作为前景的表面和以深色像素作为背景的表面6，7 来以这种方式发挥作用。通过基于高度的识别，阈值技术可以常规地将噪声与所需物体区分开来，前提是它们存在于同一焦平面内。当与基于面积的量化配对时，分水岭变换可以在典型分割技术（如边缘检测）不准确的环境中准确识别对象组。
流域变换通常与分割技术相结合，以准备图像以进行更清晰的分析，从而提高细胞计数的准确性。对于此过程，分水岭变换用于在分割之前突出显示潜在的感兴趣区域。分水岭变换通过识别图像前景中的细胞提供了独特的优势，这可以通过消除细胞的潜在误报（例如背景的不均匀斑块）来提高分割分析的准确性。然而，当试图使基于细胞的图像适应分水岭变换时，可能会出现困难。具有高细胞密度的图像可能会受到下分段的困扰，其中细胞的聚集体被识别为单一组而不是单个组分。噪声或剧烈强度变化的存在也可能导致过度分段，其中算法过度隔离细胞，导致细胞计数过多和不准确8。
在本文中，我们详细介绍了一种方法，通过将阈值分析的组件合并到基于面积的量化算法中来最小化分水岭变换的主要缺点，如图 1所示。值得注意的是，该算法是使用开源和/或广泛使用的软件实现的，并且无需昂贵的试剂或复杂的细胞制备技术即可应用该细胞计数框架。RAW264.7巨噬细胞用于证明该方法，因为它们在调节结缔组织维持和伤口愈合过程中起着关键作用9。此外，由于NIH / 3T3成纤维细胞在组织维护和修复中的关键作用，对其进行了分析。成纤维细胞通常与巨噬细胞共存并支持巨噬细胞，因此需要在共培养研究中区分这些表型不同的细胞类型。
通过计算细胞覆盖的面积和单一细胞占用的平均面积，可以可靠有效地量化具有高活细胞密度（VCD）的图像中的细胞计数。使用阈值而不是分割进行细胞鉴定也使更复杂的分析成为可能，例如同时分析共培养中不同细胞类型的实验。NIH / 3T3成纤维细胞，通常被发现与伤口愈合部位内的RAW264.7巨噬细胞共定位，被发现在与巨噬细胞10的焦平面不同的焦平面上生长。因此，根据所分析的细胞类型，运行多种阈值算法来定义背景和前景，从而能够准确计数同一图像中的两种不同细胞类型。
Protocol
Representative Results
Discussion
我们设计了一种基于区域的通用程序，可以根据细胞高度准确有效地计数细胞，即使在共培养系统中也能对细胞进行无染色定量。该程序的关键步骤包括实施相对强度系统，通过该系统可以区分细胞。使用相对高度分析有两个目的：不需要外部参数，因为给定的像元类型和参数的相对参数是恒定的，并且不需要为每个图像输入绝对亮度/对比度级别。此外，使用基于百分位数的系统可以分析同一图…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作部分由美国国立卫生研究院（R01 AR067247）资助，部分由特拉华州INBRE计划资助，由美国国立卫生研究院和特拉华州的国家普通医学科学研究所-NIGMS（P20 GM103446）资助。稿件的内容不一定反映资助机构的观点。
Materials
| Axio Observer 7 Inverted Microscope | Zeiss | 1028290770 | |
| β-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Cell Scrapers | CellTreat | 229310 | |
| Dublecco's Modified Eagle Medium | Fisher Scientific | 12430047 | |
| Dublecco's PBS | Fisher Scientific | 14190144 | |
| MATLAB Software | MathWorks | 2021A | |
| NIH/3T3 Cells | ATCC | ATCC CRL – 1658 | |
| Penicillin–Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333-20ML | |
| RAW264.7 Cells | ATCC | ATCC TIB – 71 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S6014-25G | |
| T75 Cell Culture Flask | Corning | CLS3814-24EA |
Referenzen
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