Area-based Image Analysis Algorithm zur Quantifizierung von Makrophagen-Fibroblasten-Kokulturen

Summary

Wir stellen eine Methode vor, die einen generalisierbaren flächenbasierten Bildanalyseansatz verwendet, um Zellzahlen zu identifizieren. Die Analyse verschiedener Zellpopulationen nutzte die signifikanten Zellhöhen- und Strukturunterschiede zwischen verschiedenen Zelltypen innerhalb eines adaptiven Algorithmus.

Abstract

Die Quantifizierung von Zellen ist für eine Vielzahl von biologischen und biochemischen Studien notwendig. Die konventionelle Bildanalyse von Zellen verwendet typischerweise entweder Fluoreszenzdetektionsansätze wie Immunfluoreszenzfärbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen oder Kantendetektionstechniken, die aufgrund von Rauschen und anderen Nicht-Idealitäten im Bildhintergrund oft fehleranfällig sind.

Wir haben einen neuen Algorithmus entwickelt, der Makrophagen und Fibroblasten, Zellen verschiedener Phänotypen, die oft während der Geweberegeneration kolokalisieren, genau zählen und unterscheiden kann. MATLAB wurde verwendet, um den Algorithmus zu implementieren, der verschiedene Zelltypen basierend auf Höhenunterschieden vom Hintergrund unterscheidet. Ein primärer Algorithmus wurde unter Verwendung einer flächenbasierten Methode entwickelt, um Variationen in der Zellgröße / -struktur und die Bedingungen für die Aussaat mit hoher Dichte zu berücksichtigen.

Nicht-Idealitäten in Zellstrukturen wurden mit einem sekundären, iterativen Algorithmus berücksichtigt, der interne Parameter wie die Zellbedeckung verwendet, die unter Verwendung experimenteller Daten für einen bestimmten Zelltyp berechnet wurde. Schließlich wurde eine Analyse der Kokulturumgebungen mit einem Isolationsalgorithmus durchgeführt, bei dem verschiedene Zelltypen selektiv ausgeschlossen wurden, basierend auf der Bewertung der relativen Höhenunterschiede innerhalb des Bildes. Es wurde festgestellt, dass dieser Ansatz Zellen innerhalb einer Fehlerspanne von 5% für monokultivierte Zellen und innerhalb einer Fehlerspanne von 10% für kokultivierte Zellen genau zählt.

Introduction

Software wird routinemäßig während der Bildanalysetechniken implementiert, um sicherzustellen, dass die Ergebnisse genau, effizient und unvoreingenommen sind. Bei zellbasierten Assays ist ein häufiges Problem die Fehlidentifizierung von Zellen. Bilder mit falschen Fokus- und Kontrasteinstellungen können zu Zellunschärfe führen, bei der die Grenze einzelner Zellen schwer zu identifizieren ist¹. Das Vorhandensein von Fremdbildmerkmalen wie Poren, Blasen oder anderen unerwünschten Objekten kann die Zählvorgänge behindern, indem es den Zählvorgang verlangsamt und zu einer falschen Identifizierung führt. Darüber hinaus kann das Zählen von Zellen mühsam sein, und das Zählen von Hunderten von Replikaten kann äußerst zeitaufwendig sein. Darüber hinaus besteht während der manuellen Zählung eine inhärente subjektive Verzerrung, und daher ist die Entscheidungsfindung in Bezug auf die Zellidentifizierung oft ungenau². Automatisierte Software bietet ein aufregendes Potenzial, all diese Probleme zu umgehen, indem Zellen schnell und präzise von Fremdobjekten unterschieden werden, einschließlich Objekten, die weit über die menschlichen Fähigkeiten zur präzisen Erkennung hinausgehen, basierend auf klar definierten Identifikationskriterien, die den Einfluss von Investigator Bias reduzieren. Gängige Techniken zur Identifizierung von Zellen mit automatisierter Software umfassen zwei Hauptmethoden: Segmentierung und Schwellenwert³. Hierin demonstrieren wir ein generalisierbares flächenbasiertes Protokoll, das eine schnelle, genaue und kostengünstige Zellzählung innerhalb eines allgemein zugänglichen Software-Frameworks ermöglicht.

Segmentierungstechniken, wie die Kantenerkennung, versuchen, einzelne Zellen zu isolieren, indem Intensitätsunterschiede innerhalb eines Bildes genutzt werden. Intensitätsänderungen, die eine Zelle vom Rest des Bildes unterscheiden, bestehen meistens aus scharfen Helligkeitsänderungen⁴. Die Kantenerkennung umfasst einen Regularisierungsfilterschritt, gefolgt von einem Differenzierungsschritt, in dem Intensitätsänderungen erkannt werden. Der Differenzierungsprozess identifiziert Kanten und Konturen innerhalb des Bildes von hochintensiven Veränderungen, und diese Kanten und Konturen korrelieren mit der Zellpräsenz. Obwohl Bilder mit Rauschen durch Rauschalgorithmen⁴ ausgeführt werden können, werden Kantenerkennungstechniken idealerweise für die Analyse von Bildern mit geringem Hintergrundrauschen verwendet. Der Prozess funktioniert optimal, wenn Zellgrenzen klar und leicht unterscheidbar sind und nicht durch Helligkeitskonturen behindert werden, die nichts mit Zellpräsenz, Zellunschärfe, Fremdobjekten oder definierten internen Zellstrukturen zu tun^{haben 1,2}. Wenn ein Bild besonders verrauscht ist, können Zellen durch fluoreszierende Färbung oder Transfektion mit fluoreszierenden Proteinen weiter unterschieden^{werden 2,5}. Obwohl dies die Genauigkeit der Segmentierungstechniken erheblich verbessert, erfordert dies zusätzliche Kosten und zusätzliche Zeitinvestitionen, um Zellkulturen für die Bildgebung vorzubereiten.

Schwellenwerttechniken beinhalten die Unterteilung eines Bildes in zwei Kategorien: den Vordergrund und den Hintergrund, wobei Zellen dem Vordergrund^{zugewiesen sind 3}. Diese Techniken verwenden Farb- / Kontraständerungen, um die scheinbare Höhe eines Objekts zu definieren. Objekte, die routinemäßig “höher” sind als der Hintergrund, können leicht als Zellen identifiziert werden. Die Wasserscheiden-Transformation funktioniert auf diese Weise, indem sie Oberflächen mit hellen Pixeln als Vordergrund und solchen mit dunklen Pixeln^{als Hintergrund 6,7} assoziiert. Durch höhenbasierte Identifizierung können Schwellentechniken routinemäßig Geräusche von gewünschten Objekten unterscheiden, vorausgesetzt, sie befinden sich innerhalb derselben Brennebene. In Kombination mit einer flächenbasierten Quantifizierung kann eine Wassereinzugsgebietstransformation Gruppen von Objekten in Umgebungen genau identifizieren, in denen typische Segmentierungstechniken wie die Kantenerkennung ungenau wären.

Wasserscheiden-Transformationen werden üblicherweise mit Segmentierungstechniken gekoppelt, um Bilder für eine sauberere Analyse vorzubereiten, was zu einer höheren Genauigkeit der Zellzählung führt. Für diesen Prozess wird die Wassereinzugsgebietstransformation verwendet, um potenzielle Regionen von Interesse vor der Segmentierung hervorzuheben. Eine Wasserscheidentransformation bietet einzigartige Vorteile, indem sie Zellen im Vordergrund von Bildern identifiziert, was die Genauigkeit der Segmentierungsanalyse verbessern kann, indem potenzielle Fehlalarme für Zellen entfernt werden, z. B. ungleichmäßige Hintergrundflecken. Schwierigkeiten können jedoch auftreten, wenn versucht wird, zellbasierte Bilder an eine Wasserscheide-Transformation anzupassen. Bilder mit hoher Zelldichte können mit Untersegmentierung geplagt werden, bei der Aggregate von Zellen als singuläre Gruppe und nicht als einzelne Komponenten identifiziert werden. Das Vorhandensein von Rauschen oder starken Intensitätsänderungen kann auch zu einer Übersegmentierung führen, bei der der Algorithmus die Zellen überisoliert, was zu übermäßigen und ungenauen Zellzahlen^{führt 8}.

Hierin beschreiben wir eine Methode zur Minimierung der primären Nachteile der Wassereinzugsgebietstransformation, indem Komponenten einer Schwellenwertanalyse in einen flächenbasierten Quantifizierungsalgorithmus integriert werden, wie in Abbildung 1 dargestellt. Insbesondere wurde dieser Algorithmus mit Open-Source- und / oder weit verbreiteter Software implementiert, und die Anwendung dieses Zellzähl-Frameworks war ohne teure Reagenzien oder komplexe Zellpräparationstechniken möglich. RAW264.7-Makrophagen wurden verwendet, um die Methode aufgrund ihrer kritischen Rolle bei der Regulierung der Bindegewebserhaltung und der Wundheilungsprozesse^{zu demonstrieren 9}. Darüber hinaus wurden NIH/3T3-Fibroblasten aufgrund ihrer Schlüsselrolle bei der Erhaltung und Reparatur von Gewebe analysiert. Fibroblastenzellen koexistieren oft mit Makrophagen und unterstützen sie, was die Notwendigkeit erzeugt, diese phänotypisch unterschiedlichen Zelltypen in Kokulturstudien zu unterscheiden.

Zellzahlen aus Bildern mit hoher lebensfähiger Zelldichte (VCD) konnten zuverlässig und effizient quantifiziert werden, indem die von den Zellen abgedeckte Fläche und die durchschnittliche Fläche einer einzelnen Zelle berechnet wurden. Die Verwendung von Schwellenwerten im Gegensatz zur Segmentierung für die Zellidentifikation ermöglichte auch komplexere Analysen, wie z.B. Experimente, in denen verschiedene Zelltypen in Kokulturen gleichzeitig analysiert wurden. Es wurde festgestellt, dass NIH / 3T3-Fibroblasten, die häufig mit RAW264.7-Makrophagen innerhalb einer Wundheilungsstelle kolokalisieren, auf einer fokalen Ebene wachsen, die sich von der fokalen Ebene von Makrophagen¹⁰ unterscheidet. Dementsprechend wurden mehrere Schwellenwertalgorithmen ausgeführt, um den Hintergrund und den Vordergrund in Abhängigkeit vom analysierten Zelltyp zu definieren, was eine genaue Zählung von zwei verschiedenen Zelltypen innerhalb desselben Bildes ermöglicht.

Protocol

1. Zellkultur und Bilderfassung Kultur RAW264.7 Makrophagen bei 37 °C und 5% CO2 in Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM), ergänzt mit 10% fetalem Rinderserum (FBS), 1% Penicillin-Streptomycin, 1,5 g/L Natriumbicarbonat und 5 μM β-Mercaptoethanol. Für die Monokultur-Bildgebung Kultur RAW264.7 Zellen bei einer Dichte von 25.000 Zellen/cm2 in einem 5 ml Zellkulturkolben mit 1 ml Medium. Kultur NIH/3T3-Zellen bei 37 °C und 5% CO2</su…

Representative Results

Die Analyse von nicht-bauchigen RAW264.7-Makrophagen wurde in einer Monokulturumgebung bei 25.000 Zellen/cm2 durchgeführt. Repräsentative Bilder der Zellkultur wurden aufgenommen und in MATLAB nach der Konvertierung in 8-Bit-Tiff in ImageJ verarbeitet. Algorithmusausgaben während des gesamten Prozesses wurden aufgezeichnet und in Abbildung 2 für das repräsentative Bild dokumentiert. In diesem Bild zählte der Algorithmus 226 Zellen, und diese Bildanzahl wurde durch Vergleich …

Discussion

Wir haben ein allgemeines flächenbasiertes Verfahren entwickelt, das Zellen auf der Grundlage der Zellgröße genau und effizient zählt und so eine fleckenfreie Quantifizierung von Zellen auch in Kokultursystemen ermöglicht. Kritische Schritte für dieses Verfahren waren die Implementierung eines relativen Intensitätssystems, mit dem Zellen differenziert werden konnten. Die Verwendung einer relativen Höhenanalyse diente zwei Zwecken: Die Notwendigkeit externer Parameter wurde überflüssig, da die relativen Paramete…

Materials

Axio Observer 7 Inverted Microscope	Zeiss	1028290770
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985023
Cell Scrapers	CellTreat	229310
Dublecco's Modified Eagle Medium	Fisher Scientific	12430047
Dublecco's PBS	Fisher Scientific	14190144
MATLAB Software	MathWorks	2021A
NIH/3T3 Cells	ATCC	ATCC CRL – 1658
Penicillin–Streptomycin	Sigma Aldrich	P4333-20ML
RAW264.7 Cells	ATCC	ATCC TIB – 71
Sodium Bicarbonate	Sigma Aldrich	S6014-25G
T75 Cell Culture Flask	Corning	CLS3814-24EA