הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות
Summary
הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.
Abstract
Osteosarcoma הוא סרטן העצם העיקרי הנפוץ ביותר אצל ילדים ומתבגרים, עם ריאות כאתר גרורתי הנפוץ ביותר. שיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות הוא פחות מ -30%. לכן, השימוש של מודלים עכבר מחקה את התפתחות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה להבנת המנגנון הבסיסי של קרצינוגנזה osteosarcoma וגרורות ריאתי לפתח טיפוליים חדשניים. כאן, נהלים מפורטים מדווחים כדי ליצור את מודלים עכבר גרורות אוסטאוזרקומה ריאות העיקרי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma. בשילוב עם bioluminescence או מערכת הדמיה חיה רנטגן, מודלים אלה עכבר חי מנוצלים כדי לפקח ולכמת את צמיחת osteosarcoma וגרורות. כדי להקים מודל זה, מטריצת קרום מרתף המכילה תאי osteosarcoma נטען במזרק מיקרו נפח והוזרק לתוך שוקה אחת של כל עכבר אתימי לאחר שהיה מורדם. העכברים הוקרבו כאשר האוסטאוסרקומה העיקרית הגיעה למגבלת הגודל בפרוטוקול שאושר על ידי IACUC. הרגליים הנושאות אוסטאוסרקומה והריאות עם נגעי גרורות הופרדו. מודלים אלה מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה, נגעים חמורים ורגישות בניטור התפתחות נגעים גרורתיים ראשוניים ובריאתיים. לכן, אלה הם מודלים אידיאליים לחקר הפונקציות והמנגנונים של גורמים ספציפיים אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות, מיקרו-סביבה של הגידול, והערכה של היעילות הטיפולית ב- vivo.
Introduction
אוסטאוסרקומה היא סרטן העצמות העיקרי הנפוץ ביותר בקרב ילדים ומתבגרים 1,2, אשר בעיקר חודר לרקמה שמסביב, ואפילו גרורות לריאות כאשר החולים מאובחנים. גרורות ריאתיות הן האתגר העיקרי לטיפול באוסטיוסרקומה, ושיעור ההישרדות של חמש שנים של חולי אוסטאוסרקומה עם גרורות ריאתיות נשאר נמוך כמו 20%-30%-30%3,4,5. עם זאת, שיעור ההישרדות של חמש שנים של אוסטאוסרקומה ראשונית הוגדל לכ -70% מאז שנות השבעים עקב כניסתו של כימותרפיה6. לכן, יש צורך דחוף כדי להבין את המנגנון הבסיסי של אוסטאוסרקומה קרצינוגנזה וגרורות ריאתיות לפתח טיפולים חדשניים. היישום של מודלים עכבר המחקים בצורה הטובה ביותר את התקדמות osteosarcoma בבני אדם הוא בעל משמעות רבה7.
מודלים בעלי חיים osteosarcoma נוצרים על ידי ספונטני, המושרה הנדסה גנטית, השתלה, וטכניקות אחרות. מודל האוסטאוסרקומה הספונטני משמש לעתים רחוקות בשל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור התרחשות הגידול הלא עקבי, תחלואה נמוכה ויציבות ירודה 8,9. למרות מודל osteosarcoma המושרה נגיש יותר להשיג מאשר osteosarcoma ספונטני, היישום של מודל osteosarcoma המושרה מוגבל כי הגורם המעורר ישפיע על microenvironment, הפתוגנזה, ואת המאפיינים הפתולוגיים של osteosarcoma10. מודלים מהונדסים עוזרים להבין את הפתוגנזה של סרטן שכן הם יכולים לדמות טוב יותר את הסביבות הפיזיולוגיות והפתולוגיות האנושיות; עם זאת, מודלים בעלי חיים מהונדסים יש גם את המגבלות שלהם בשל הקושי, לטווח ארוך, ועלות גבוהה של שינוי מהונדס. יתר על כן, אפילו במודלים המקובלים ביותר של בעלי חיים מהונדסים שנוצרו על ידי p53 ושינוי גנים Rb, רק 13.6% מהסרקומה התרחשה בארבע עצמות הגפיים11,12.
השתלה היא אחת השיטות הנפוצות ביותר לייצור מודלים גרורתיים גרורתיים ראשוניים ורחוקים בשנים האחרונות בשל התמרון הפשוט שלה, קצב היווצרות הגידול היציב והומוגניותטובה יותר 13. ההשתלה כוללת השתלה הטרוטופית והשתלות אורתוטופיות על פי אתרי ההשתלה. בהשתלה הטרוטופית של אוסטאוסרקומה, תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים מחוץ לאתרי האוסטאוסרקומה העיקריים (עצם) של בעלי החיים, בדרך כלל מתחת לעור, תת עורית14. למרות ההשתלה ההטרוטופית היא פשוטה ללא צורך לבצע ניתוח בבעלי חיים, האתרים שבהם תאי osteosarcoma מוזרקים אינם מייצגים את המיקרו-סביבה של אוסטאוסרקומה אנושית בפועל. השתלה אורתוטופית אוסטאוסרקומה היא כאשר תאי האוסטאוסרקומה מוזרקים לעצמות של בעלי חיים, כגון שוקה15,16. בהשוואה לשתלים ההטרוטופיים, שתלי אוסטאוסרקומה אורתוטופיים מאופיינים בתקופת דגירה קצרה, צמיחה מהירה ואופי שוחק חזק; לכן, הם מודלים בעלי חיים אידיאליים עבור מחקרים הקשורים osteosarcoma17.
בעלי החיים הנפוצים ביותר הם עכברים, כלבים ודגי זברה18,19. המודל הספונטני של osteosarcoma משמש בדרך כלל בכלבים כי osteosarcoma הוא אחד הגידולים הנפוצים ביותר בכלבים. עם זאת, היישום של מודל זה מוגבל בגלל זמן היווצרות הגידול הארוך, שיעור הגידול הנמוך, הומוגניות ירודה ויציבות. דגי זברה משמשים לעתים קרובות לבניית מודלים מהונדסים או נוקאאוט גידול בגלל הרבייה המהירה שלהם20. אבל גנים של דגי זברה שונים מהגנים האנושיים, ולכן היישומים שלהם מוגבלים.
עבודה זו מתארת את ההליכים המפורטים, אמצעי זהירות, ותמונות מייצגות לייצור osteosarcoma העיקרי בשוקה עם גרורות ריאתי באמצעות הזרקת intratibia של תאי osteosarcoma בעכברים אתימיים. שיטה זו יושמה כדי ליצור את osteosarcoma העיקרי בשוקת העכבר להערכת יעילות טיפולית, אשר הראה רבייה גבוהה21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
הזרקה אורתוטופית של תאי אוסטאוסרקומה היא מודל אידיאלי לחקר הפונקציה והמנגנון של גורמים ספציפיים ב- osteosarcoma carcinogenesis ופיתוח כדי להעריך את היעילות הטיפולית. כדי למנוע הבדלים בצמיחת הגידול, רוב תאי האוסטאוסרקומה הפעילים ב 80%-90% במפגש עם אותו מספר מוזרקים בקפידה לתוך השוקה של כל עכבר, וזמן טריפ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מ(1) תוכנית מו”פ המפתח הלאומית של סין (2018YFC1704300 ו-2020YFE0201600), (2) הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו-82174408).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
Referenzen
- Bielack, S. S., et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysis of 1,702 patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols. Journal of Clinical Oncology. 20 (3), 776-790 (2002).
- Yang, C., et al. Bone microenvironment and osteosarcoma metastasis. International Journal of Molecular Sciences. 21 (19), (2020).
- Mirabello, L., Troisi, R. J., Savage, S. A. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the Surveillance, Epidemiology, and End Results Program. Cancer. 115 (7), 1531-1543 (2009).
- Zhang, B., et al. The efficacy and safety comparison of first-line chemotherapeutic agents (high-dose methotrexate, doxorubicin, cisplatin, and ifosfamide) for osteosarcoma: a network meta-analysis. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 15 (1), 51 (2020).
- Tsukamoto, S., Errani, C., Angelini, A., Mavrogenis, A. F. Current treatment considerations for osteosarcoma metastatic at presentation. Orthopedics. 43 (5), 345-358 (2020).
- Aljubran, A. H., Griffin, A., Pintilie, M., Blackstein, M. Osteosarcoma in adolescents and adults: survival analysis with and without lung metastases. Annals of Oncology. 20 (6), 1136-1141 (2009).
- Ek, E. T., Dass, C. R., Choong, P. F. Commonly used mouse models of osteosarcoma. Critical Reviews in Oncology/Hematology. 60 (1), 1-8 (2006).
- Castillo-Tandazo, W., Mutsaers, A. J., Walkley, C. R. Osteosarcoma in the post genome era: Preclinical models and approaches to identify tractable therapeutic targets. Current Osteoporosis Reports. 17 (5), 343-352 (2019).
- Mason, N. J. Comparative immunology and immunotherapy of canine osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1258, 199-221 (2020).
- Cobb, L. M. Radiation-induced osteosarcoma in the rat as a model for osteosarcoma in man. British Journal of Cancer. 24 (2), 294-299 (1970).
- Walkley, C. R., et al. Conditional mouse osteosarcoma, dependent on p53 loss and potentiated by loss of Rb, mimics the human disease. Genes & Development. 22 (12), 1662-1676 (2008).
- Entz-Werlé, N., et al. Targeted apc;twist double-mutant mice: a new model of spontaneous osteosarcoma that mimics the human disease. Translational Oncology. 3 (6), 344-353 (2010).
- Erstad, D. J., et al. Orthotopic and heterotopic murine models of pancreatic cancer and their different responses to FOLFIRINOX chemotherapy. Disease Models & Mechanisms. 11 (7), (2018).
- Chang, J., et al. MicroRNAs for osteosarcoma in the mouse: a meta-analysis. Oncotarget. 7 (51), 85650-85674 (2016).
- Maloney, C., et al. Intratibial injection causes direct pulmonary seeding of osteosarcoma cells and is not a spontaneous model of metastasis: A mouse osteosarcoma model. Clinical Orthopaedics and Related Research. 476 (7), 1514-1522 (2018).
- Yu, Z., et al. Establishment of reproducible osteosarcoma rat model using orthotopic implantation technique. Oncology Reports. 21 (5), 1175-1180 (2009).
- Fidler, I. J., Naito, S., Pathak, S. Orthotopic implantation is essential for the selection, growth and metastasis of human renal cell cancer in nude mice [corrected]. Cancer Metastasis Reviews. 9 (2), 149-165 (1990).
- Leacock, S. W., et al. A zebrafish transgenic model of Ewing’s sarcoma reveals conserved mediators of EWS-FLI1 tumorigenesis. Disease Models & Mechanisms. 5 (1), 95-106 (2012).
- Sharma, S., Boston, S. E., Riddle, D., Isakow, K. Osteosarcoma of the proximal tibia in a dog 6 years after tibial tuberosity advancement. The Canadian Veterinary Journal. 61 (9), 946-950 (2020).
- Mohseny, A. B., Hogendoorn, P. C. Zebrafish as a model for human osteosarcoma. Advances in Experimental Medicine and Biology. 804, 221-236 (2014).
- Hu, S., et al. Cantharidin inhibits osteosarcoma proliferation and metastasis by directly targeting miR-214-3p/DKK3 axis to inactivate β-catenin nuclear translocation and LEF1 translation. International Journal of Biological Sciences. 17 (10), 2504-2522 (2021).
- Chang, J., et al. Polyphyllin I suppresses human osteosarcoma growth by inactivation of Wnt/β-catenin pathway in vitro and in vivo. Scientific Reports. 7 (1), 7605 (2017).
- Lamar, J. M., et al. SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis. The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).
- Benton, G., Arnaoutova, I., George, J., Kleinman, H. K., Koblinski, J. Matrigel: from discovery and ECM mimicry to assays and models for cancer research. Advanced Drug Delivery Reviews. , 3-18 (2014).
- Chang, J., et al. Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition. Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).
- Fridman, R., et al. Enhanced tumor growth of both primary and established human and murine tumor cells in athymic mice after coinjection with Matrigel. Journal of the National Cancer Institute. 83 (11), 769-774 (1991).
- Kocatürk, B., Versteeg, H. H. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mammary fat pad of mice to study tumor growth. Journal of Visualized Experiments. (96), e51967 (2015).
- Paschall, A. V., Liu, K. An orthotopic mouse model of spontaneous breast cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (114), e54040 (2016).
- Hildreth, B. E., Palmer, C., Allen, M. J. Modeling primary bone tumors and bone metastasis with solid tumor graft implantation into bone. Journal of Visualized Experiments. (163), e61313 (2020).
- Campbell, J. P., Merkel, A. R., Masood-Campbell, S. K., Elefteriou, F., Sterling, J. A. Models of bone metastasis. Journal of Visualized Experiments. (67), e4260 (2012).
