Iniezione di cellule di osteosarcoma intratibiale per generare modelli murini di osteosarcoma ortotopico e metastasi polmonari
Summary
Il presente protocollo descrive l’iniezione di cellule di osteosarcoma intratibia per generare modelli murini portatori di osteosarcoma ortotopico e lesioni da metastasi polmonari.
Abstract
L’osteosarcoma è il tumore osseo primario più comune nei bambini e negli adolescenti, con i polmoni come sito metastatico più comune. Il tasso di sopravvivenza a cinque anni dei pazienti con osteosarcoma con metastasi polmonari è inferiore al 30%. Pertanto, l’utilizzo di modelli murini che imitano lo sviluppo dell’osteosarcoma negli esseri umani è di grande importanza per comprendere il meccanismo fondamentale della carcinogenesi dell’osteosarcoma e delle metastasi polmonari per sviluppare nuove terapie. Qui, vengono riportate procedure dettagliate per generare l’osteosarcoma primario e i modelli murini di metastasi polmonari tramite iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma. In combinazione con il sistema di bioluminescenza o di imaging live a raggi X, questi modelli murini viventi vengono utilizzati per monitorare e quantificare la crescita e le metastasi dell’osteosarcoma. Per stabilire questo modello, una matrice di membrana basale contenente cellule di osteosarcoma è stata caricata in una siringa a micro-volume e iniettata in una tibia di ciascun topo atimico dopo essere stata anestetizzata. I topi sono stati sacrificati quando l’osteosarcoma primario ha raggiunto il limite di dimensioni nel protocollo approvato dalla IACUC. Le gambe portanti osteosarcoma e i polmoni con lesioni metastasi sono stati separati. Questi modelli sono caratterizzati da un breve periodo di incubazione, rapida crescita, lesioni gravi e sensibilità nel monitoraggio dello sviluppo di lesioni metastatiche primarie e polmonari. Pertanto, questi sono modelli ideali per esplorare le funzioni e i meccanismi di fattori specifici nella carcinogenesi dell’osteosarcoma e nelle metastasi polmonari, nel microambiente tumorale e valutare l’efficacia terapeutica in vivo.
Introduction
L’osteosarcoma è il tumore osseo primario più comune nei bambini e negli adolescenti 1,2, che si infiltra principalmente nel tessuto circostante e persino metastatizza ai polmoni quando i pazienti vengono diagnosticati. Le metastasi polmonari sono la sfida principale per la terapia con osteosarcoma e il tasso di sopravvivenza a cinque anni dei pazienti con osteosarcoma con metastasi polmonari rimane basso come 20%-30%3,4,5. Tuttavia, il tasso di sopravvivenza a cinque anni dell’osteosarcoma primario è stato aumentato a circa il 70% dal 1970 a causa dell’introduzione della chemioterapia6. Pertanto, è urgente comprendere il meccanismo fondamentale della carcinogenesi dell’osteosarcoma e delle metastasi polmonari per sviluppare nuove terapie. L’applicazione di modelli murini che meglio imitano la progressione dell’osteosarcoma negli esseri umani è di grande importanza7.
I modelli animali di osteosarcoma sono generati da ingegneria genetica spontanea indotta, trapianto e altre tecniche. Il modello di osteosarcoma spontaneo è usato raramente a causa del lungo tempo di formazione del tumore, del tasso di insorgenza tumorale incoerente, della bassa morbilità e della scarsa stabilità 8,9. Sebbene il modello di osteosarcoma indotto sia più accessibile da ottenere rispetto all’osteosarcoma spontaneo, l’applicazione del modello di osteosarcoma indotto è limitata perché il fattore induttore influenzerà il microambiente, la patogenesi e le caratteristiche patologiche dell’osteosarcoma10. I modelli transgenici stanno aiutando a comprendere la patogenesi dei tumori poiché possono simulare meglio gli ambienti fisiologici e patologici umani; tuttavia, i modelli animali transgenici hanno anche i loro limiti a causa della difficoltà, del lungo termine e dell’alto costo della modifica transgenica. Inoltre, anche nei modelli animali transgenici più ampiamente accettati generati dalla modificazione del gene p53 e Rb, solo il 13,6% del sarcoma si è verificato nelle ossa dei quattro arti11,12.
Il trapianto è uno dei metodi di produzione di modelli di cancro metastatico primario e a distanza più comunemente usati negli ultimi anni grazie alla sua semplice manovra, al tasso di formazione del tumore stabile e alla migliore omogeneità13. Il trapianto comprende il trapianto eterotopico e il trapianto ortotopico in base ai siti di trapianto. Nel trapianto eterotopico di osteosarcoma, le cellule dell’osteosarcoma vengono iniettate al di fuori dei siti primari di osteosarcoma (osso) degli animali, comunemente sotto la pelle, per via sottocutanea14. Sebbene il trapianto eterotopico sia semplice senza la necessità di eseguire interventi chirurgici negli animali, i siti in cui vengono iniettate le cellule dell’osteosarcoma non rappresentano l’effettivo microambiente dell’osteosarcoma umano. Il trapianto ortotopico di osteosarcoma è quando le cellule dell’osteosarcoma vengono iniettate nelle ossa degli animali, come la tibia15,16. Rispetto agli innesti eterotopici, gli innesti di osteosarcoma ortotopico sono caratterizzati da un breve periodo di incubazione, rapida crescita e forte natura erosiva; pertanto, sono modelli animali ideali per gli studi relativi all’osteosarcoma17.
Gli animali più comunemente usati sono topi, cani e pesci zebra18,19. Il modello spontaneo di osteosarcoma è solitamente usato nei cani perché l’osteosarcoma è uno dei tumori più comuni nei cani. Tuttavia, l’applicazione di questo modello è limitata a causa del lungo tempo di formazione del tumore, del basso tasso di tumorigenesi, della scarsa omogeneità e della stabilità. I pesci zebra sono spesso usati per costruire modelli tumorali transgenici o knockout a causa della loro rapida riproduzione20. Ma i geni zebrafish sono diversi dai geni umani, quindi le loro applicazioni sono limitate.
Questo lavoro descrive le procedure dettagliate, le precauzioni e le immagini rappresentative per la produzione dell’osteosarcoma primario nella tibia con metastasi polmonari tramite iniezione intratibiale di cellule di osteosarcoma in topi atimici. Questo metodo è stato applicato per creare l’osteosarcoma primario nella tibia del topo per la valutazione dell’efficacia terapeutica, che ha mostrato un’elevata riproducibilità21,22.
Protocol
Representative Results
Discussion
L’iniezione ortotopica di cellule di osteosarcoma è un modello ideale per studiare la funzione e il meccanismo di fattori specifici nella carcinogenesi dell’osteosarcoma e nello sviluppo per valutare l’efficacia terapeutica. Per evitare differenze nella crescita del tumore, la maggior parte delle cellule di osteosarcoma attive all’80% -90% confluenti con lo stesso numero vengono accuratamente iniettate nella tibia di ciascun topo e il tempo di tripsinizzazione cellulare è strettamente controllato senza influire sulla v…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo studio è stato supportato da sovvenzioni di (1) National Key R&D Program of China (2018YFC1704300 e 2020YFE0201600), (2) National Nature Science Foundation (81973877 e 82174408).
Materials
| Automatic cell counter | Shanghai Simo Biological Technology Co., Ltd | IC1000 | Counting cells |
| Anesthesia machine | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | R500IP | The Equipment of Anesthesia mice |
| BALB/c athymic mice | Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd. | / | animal |
| Basement Membrane Matrix | Shanghai Uning Bioscience Technology Co., Ltd | 356234, BD, Matrigel | re-suspende cells |
| Bioluminescence imaging system | Shanghai Baitai Technology Co., Ltd | Vieworks | tracking the tumor growth and pulmonary metastasis, if the injection cell is labeled by luciferase |
| Centrifuge tube (15 mL) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 430790, Corning | Centrifuge the cells |
| isoflurane | Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd | VETEASY | Anesthesia mice |
| MEM media | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | LM-E1141 | Cell culture medium |
| Micro-volume syringe | Shanghai high pigeon industry and trade Co., Ltd | 0-50 μL | Inject precise cells into the tibia |
| Phosphate-buffered saline | Beyotime Biotechnology | ST447 | wash the human osteosarcoma cells |
| 1ml syringes | Shandong Weigao Group Medical Polymer Co., Ltd | 20200411 | drilling |
| 143B cell line | ATCC | CRL-8303 | osteosarcoma cell line |
| Trypsin (0.25%) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 25200056, Gibco | trypsin treatment of cells |
| Trypan blue | Beyotime Biotechnology | ST798 | Staining cells to assess activity |
| vector (pLV-luciferase) | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | VL3613 | Plasmid |
| Lipofectamine 2000 | Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd | 11668027,Thermo fisher | Plasmid transfection reagent |
| X-ray imaging system | Brook (Beijing) Technology Co., Ltd | FX PRO | X-ray images were obtained to detect tumor growth |
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