Imágenes 3D de la matriz extracelular hepática en un modelo de ratón de esteatohepatitis no alcohólica
Summary
El presente protocolo optimiza los métodos de perfusión/descelularización in situ hepática y microscopía de dos fotones para establecer una plataforma confiable para visualizar la dinámica de la remodelación de la matriz extracelular (MEC) durante la esteatohepatitis no alcohólica (EHNA).
Abstract
La esteatohepatitis no alcohólica (EHNA) es la enfermedad hepática crónica más común en los Estados Unidos, que afecta a más de 70 millones de estadounidenses. NASH puede progresar a fibrosis y, finalmente, a cirrosis, un factor de riesgo significativo para el carcinoma hepatocelular. La matriz extracelular (ECM) proporciona soporte estructural y mantiene la homeostasis hepática a través de señales matricelulares. La fibrosis hepática es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la ECM y se caracteriza por una acumulación excesiva de elementos estructurales y cambios asociados en los glicosaminoglicanos. El patrón de fibrosis típico de NASH se llama “alambre de pollo”, que generalmente consiste en fibrosis perisinusoidal/pericelular de zona 3, según las características observadas por la tinción tricrómica de Masson y las tinciones de rojo de Picrosirius. Sin embargo, estas técnicas tradicionales de imágenes bidimensionales delgadas (2D) basadas en diapositivas de tejido no pueden demostrar los cambios estructurales detallados de ECM tridimensional (3D), lo que limita la comprensión de la remodelación dinámica de ECM en la fibrosis hepática.
El trabajo actual optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la estructura nativa de ECM en el hígado a través de la descelularización para abordar los desafíos anteriores. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión de la vena porta in situ , y las técnicas de microscopía de dos fotones se aplicaron para obtener imágenes y analizar los cambios en la ECM nativa. Las imágenes 3D de los hígados normal y NASH fueron reconstituidas y analizadas. La realización de la descelularización de perfusión in situ y el análisis del andamio mediante microscopía de dos fotones proporcionaron una plataforma práctica y confiable para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.
Introduction
La enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD) es la enfermedad hepática más común, que afecta al 20% -25% de la población adulta. El 25% de los pacientes con NAFLD progresan a esteatohepatitis no alcohólica (NASH), donde el riesgo de cirrosis, insuficiencia hepática y carcinoma hepatocelular aumenta1. En los próximos 20 años, se estima que NASH representará 2 millones de muertes relacionadas con el hígado en EE.UU.2. Como no existen tratamientos aprobados, existe una necesidad urgente de descifrar los mecanismos que causan fibrosis hepática en pacientes con EHNA y desarrollar un tratamiento dirigido3.
La matriz extracelular (MEC) es un microambiente dinámico y complejo que ejerce comunicación bidireccional con las células para regular la homeostasis tisular4. La ECM hepática está compuesta por elementos estructurales como proteoglicanos, colágenos, fibronectina, elastina y otras proteínas no estructurales (por ejemplo, olfactomedina y trombospondina) para proporcionar soporte físico y estructural4.
La fibrosis hepática es una respuesta crónica de cicatrización de heridas al daño hepático de diversas etiologías, incluida la EHNA3. Es el resultado de un desequilibrio en el proceso dinámico de remodelación de la matriz ECM y se caracteriza por un exceso de proteínas estructurales en el hígado lesionado4. La fibrogénesis depende de la comunicación dinámica célula-célula entre los diferentes tipos de células hepáticas. Las células estrelladas hepáticas (HSC), cuando se activan, se diferencian en células similares a miofibroblastos que expresan actina, migran y proliferan en músculo liso alfa 2 y sintetizan proteínas ECM como una acción de cierre de heridas. Las HSC activadas son las células productoras de colágeno central en el hígado1.
El mecanismo molecular de la remodelación de la ECM, los patrones de fibrosis y su relación con los eventos celulares no están claros. Todavía se necesita una mejor comprensión de la estructura tridimensional (3D) de la ECM, a pesar de que las técnicas de espectrometría de masas han ayudado a analizar la composición de la proteína ECM4. Tradicionalmente, la tinción tricrómica de Masson, las tinciones de rojo Picro Sirius y las imágenes de segunda generación armónica (SHG) se han realizado en secciones delgadas del hígado bidimensionales (2D). El patrón típico de fibrosis de NASH se llama “alambre de gallina”, que se extiende a la zona 3 y es fibrosis perisinusoidal/pericelular 5,6. Sin embargo, ha habido una falta de estudios centrados en la estructura 3D del hígado nativo, particularmente aquellos que no implican la sección de tejido. Los enfoques de imagen robustos para identificar patrones y características de la fibrosis a través de la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática fortalecerían significativamente la comprensión de los mecanismos de NASH e identificarían nuevos objetivos terapéuticos.
Para abordar estos desafíos, se optimizó un protocolo rápido y eficiente para obtener imágenes de la ECM hepática nativa a través de la descelularización7. La descelularización de todo el hígado es un enfoque para eliminar el contenido celular hepático mientras se mantiene la red 3D ECM nativa a través de la perfusión detergente. Los ratones fueron alimentados con comida o dieta de comida rápida (FFD) durante 14 semanas. La descelularización se realizó después de la perfusión in situ de la vena porta con detergente suave y bajas tasas de flujo para preservar las estructuras de colágeno fibrilar triple helicoidal y nativas. Se aplicó microscopía de dos fotones para analizar los cambios en las estructuras de colágeno en la ECM. Se reconstituyeron y analizaron las imágenes 3D de la estructura nativa de ECM en hígados normales y NASH. Realizar la descelularización de perfusión in situ y analizar el andamio mediante microscopía de dos fotones proporciona una plataforma práctica y asequible para visualizar la remodelación dinámica de ECM en el hígado.
Protocol
Representative Results
Discussion
El presente protocolo muestra que la descelularización a través de una perfusión in situ DOC de bajo caudal preserva las estructuras frangibles de colágeno fibrilar de triple hélice y nativas, proporcionando una plataforma confiable y rentable para capturar la remodelación dinámica de la ECM en la fibrosis hepática NASH. Aunque la descelularización se realizó en hígados normales y fibróticos antes de identificar componentes de la MCE o generar andamios biológicos para cultivo celular, la dinámica d…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Hyesuk Park por la ayuda técnica. Esta investigación fue apoyada por fondos del Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, a NJT), el Instituto Nacional sobre el Envejecimiento (NIA), NIH (1R01AG060726, a NJT). Agradecemos a Jon Mulholland y Kitty Lee del Centro de Imágenes de Ciencias Celulares en el Centro Beckman por su asistencia técnica con las imágenes de microscopía de dos fotones.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
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