Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi
Summary
Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.
Abstract
Alkolsüz steatohepatit (NASH), Amerika Birleşik Devletleri’nde 70 milyondan fazla Amerikalıyı etkileyen en yaygın kronik karaciğer hastalığıdır. NASH, fibrozise ve nihayetinde hepatosellüler karsinom için önemli bir risk faktörü olan siroza ilerleyebilir. Hücre dışı matriks (ECM) yapısal destek sağlar ve matrisellüler sinyaller yoluyla karaciğer homeostazını korur. Karaciğer fibrozisi, dinamik ECM yeniden şekillenme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yapısal elementlerin aşırı birikimi ve glikozaminoglikanlarda ilişkili değişiklikler ile karakterizedir. NASH’ın tipik fibroz paterni, Masson’un trikrom boyası ve Picrosirius Kırmızı lekeleri tarafından gözlemlenen özelliklere dayanarak, genellikle bölge 3 perisinüzoidal / perisellüler fibrozdan oluşan “tavuk teli” olarak adlandırılır. Bununla birlikte, bu geleneksel ince iki boyutlu (2D) doku slaytına dayalı görüntüleme teknikleri, ayrıntılı üç boyutlu (3D) ECM yapısal değişikliklerini gösteremez ve karaciğer fibrozunda dinamik ECM yeniden şekillenmesinin anlaşılmasını sınırlar.
Mevcut çalışma, yukarıdaki zorlukları ele almak için desellülarizasyon yoluyla karaciğerdeki doğal ECM yapısını görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokolü optimize etti. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti ile beslendi. Desellülarizasyon in situ portal ven perfüzyonundan sonra yapıldı ve iki fotonlu mikroskopi teknikleri doğal ECM’deki değişiklikleri görüntülemek ve analiz etmek için uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerinin 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve güvenilir bir platform sağlamıştır.
Introduction
Non-alkolik yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD), yetişkin popülasyonun% 20-25’ini etkileyen en yaygın karaciğer hastalığıdır. NAFLD hastalarının% 25’i siroz, karaciğer yetmezliği ve hepatosellüler karsinom riskinin arttığı alkolsüz steatohepatite (NASH) ilerler1. Önümüzdeki 20 yıl içinde, NASH’ın ABD 2’de2 milyon karaciğere bağlı ölümden sorumlu olacağı tahmin edilmektedir. Onaylanmış tedavileri olmadığından, NASH hastalarında karaciğer fibrozuna neden olan mekanizmaların deşifre edilmesine ve hedefe yönelik tedavinin geliştirilmesine acil ihtiyaç vardır3.
Hücre dışı matriks (ECM), doku homeostazını düzenlemek için hücrelerle çift yönlü iletişim kuran dinamik, karmaşık bir mikro ortamdır4. Karaciğer ECM, fiziksel ve yapısal destek sağlamak için proteoglikanlar, kollajenler, fibronektin, elastin ve diğer yapısal olmayan proteinler (örneğin, olfaktomedin ve trombozpondin) gibi yapısal elemanlardan oluşur4.
Karaciğer fibrozisi, NASH3 dahil olmak üzere çeşitli etiyolojilerin karaciğer hasarına karşı kronik yara iyileşmesi yanıtıdır. Dinamik ECM matriks yeniden şekillendirme sürecindeki bir dengesizlikten kaynaklanır ve yaralı karaciğerde aşırı yapısal proteinler ile karakterizedir4. Fibrogenez, farklı hepatik hücre tipleri arasındaki dinamik hücre-hücre iletişimine bağlıdır. Hepatik yıldız hücreleri (HSC’ler), aktive edildiğinde, Düz Kas Alfa 2 Aktin eksprese eden, göç eden ve çoğalan miyofibroblast benzeri hücrelere farklılaşır ve ECM proteinlerini yara kapatma eylemi olarak sentezler. Aktive HSC’ler karaciğerdeki merkezi kollajen üreten hücrelerdir1.
ECM yeniden şekillenmesinin moleküler mekanizması, fibrozis paternleri ve hücresel olaylarla ilişkisi açık değildir. Kütle spektrometresi teknikleri ECM protein bileşimi4’ün analiz edilmesine yardımcı olsa da, üç boyutlu (3D) ECM yapısının daha iyi anlaşılması hala gereklidir. Geleneksel olarak, Masson’un trikrom boyası, Picro Sirius Kırmızı lekeleri ve ikinci harmonik nesil (SHG) görüntüleme iki boyutlu (2D) ince karaciğer kesitlerinde gerçekleştirilmiştir. NASH’ın tipik fibroz paterni, bölge 3’e uzanan ve perisinüzoidal / perisellüler fibroz 5,6 olan “tavuk teli” olarak adlandırılır. Bununla birlikte, doğal karaciğerin 3D yapısına, özellikle de doku bölümlemesini içermeyenlere odaklanan çalışmaların eksikliği olmuştur. Karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesi sırasında fibrozisin paternlerini ve özelliklerini tanımlamak için sağlam görüntüleme yaklaşımları, NASH mekanizmalarının anlaşılmasını ve yeni terapötik hedeflerin belirlenmesini önemli ölçüde güçlendirecektir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, doğal karaciğer ECM’sini hücre desellülarizasyonu yoluyla görüntülemek için hızlı ve verimli bir protokol optimize edilmiştir7. Tüm karaciğer desellülarizasyonu, deterjan perfüzyonu yoluyla doğal 3D ECM ağını korurken hepatik hücresel içeriği uzaklaştırmak için bir yaklaşımdır. Fareler 14 hafta boyunca chow veya fast-food diyeti (FFD) ile beslendi. Üçlü helisel ve doğal fibriller kollajen yapılarını korumak için hafif deterjan ve düşük akış hızı ile in situ portal ven perfüzyonu sonrası desellülarizasyon yapıldı. ECM’de kollajen yapılarındaki değişiklikleri analiz etmek için iki foton mikroskobu uygulandı. Normal ve NASH karaciğerlerindeki doğal ECM yapısının 3D görüntüleri yeniden oluşturuldu ve analiz edildi. İn situ perfüzyon desellülarizasyonunun yapılması ve iskelenin iki foton mikroskobu ile analiz edilmesi, karaciğerdeki dinamik ECM yeniden şekillenmesini görselleştirmek için pratik ve uygun fiyatlı bir platform sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mevcut protokol, düşük akış hızına sahip DOC in situ perfüzyon yoluyla desellülarizasyonun, NASH karaciğer fibrozisinde dinamik ECM yeniden şekillenmesini yakalamak için güvenilir ve uygun maliyetli bir platform sağlayarak, kırılabilir üçlü sarmal ve doğal fibriller kollajen yapılarını koruduğunu göstermektedir. ECM bileşenlerini tanımlamadan veya hücre kültürü için biyolojik iskeleler oluşturmadan önce normal ve fibrotik karaciğerlerde desellülarizasyon yapılmasına rağmen,…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Teknik yardım için Hyesuk Park’a teşekkür ederiz. Bu araştırma, Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü (NIDDK), NIH (R01 2DK083283, NJT’ye), Ulusal Yaşlanma Enstitüsü (NIA), NIH (1R01AG060726, NJT’ye) tarafından finanse edilmiştir. Beckman Merkezi’ndeki Hücre Bilimleri Görüntüleme Tesisi’nden Jon Mulholland ve Kitty Lee’ye iki fotonlu mikroskopi görüntüleme ile ilgili teknik yardım için minnettarız.
Materials
| 4-0 MONOCRYL UNDYED 1 x 18" P-3 | MONOCRYL | Y494G | |
| 4-0 suture | fisher scientific | 10-000-649 | https://www.fishersci.com/shop/products/monomid-nylon-non-absorbable-sutures-7/10000649?keyword=true |
| AnaSed Injection (xylazine) | AnaSed | NDC 59399-110-20 | this drug to use by or on the order of a licensed veterinarian. |
| BD INSYTE AUTOGUARD I.V. CATHETER WITH BC TECHNOLOGY | BD | 382612 | |
| Chow diet | Envigo | # 2918 | Control diet. A fixed formula, non-autoclavable diet manufactured with high quality ingredients and designed to support gestation, lactation, and growth of rodents. |
| Fast-food diet (AIN76A Western Diet) | Test Diet | 1810060 | https://www.testdiet.com/cs/groups/lolweb/@testdiet/documents/web_content/mdrf/mdux/~edisp/ducm04_051601.pdf |
| Hematoxylin and Eosin Stain Kit | vectorlabs | H-3502 | https://vectorlabs.com/hematoxylin-and-eosin-stain-kit.html |
| Kent Scientific Rat Surgical Kit | fisher scientific | 13-005-205 | https://www.fishersci.com/shop/products/rat-surgical-kit/13005205#?keyword=mouse%20surgery%20kit |
| KETAMINE HYDROCHLORIDE INJECTION | Vedco | NDC 50989-996-06 – 10 mL – vial. | KetaVed has been clinically studied in subhuman primates in addition to those species listed under Administration and Dosage. |
| Leica SP5 upright Confocal, multi-photon | Leica | SP5 | |
| Luer connector (Three-way stopcock with SPIN-LOCK®) | bbraun | D300 | https://www.bbraunusa.com/en/products/b0/three-way-stopcockwithspin-lock.html |
| Picrosirius Red Stain Kit | Polysciences, Inc. | 24901 | https://www.polysciences.com/default/picrosirius-red-stain-kit-40771 |
| Rayon tipped applicator | puritan | 25-806 1PR | |
| Sodium deoxycholate | sigmaaldrich | D6750-100G | |
| Syrup | www.target.com | 24 fl oz | https://www.target.com/p/pancake-syrup-24-fl-oz-market-pantry-8482/-/A-13007801 |
| Variable Speed Peristaltic Pump | INTLLAB | BT100 | https://www.amazon.com/gp/product/B082K97W5W/ref=ox_sc_saved_title_2?smid=A12NUUP87ZRRAR&psc=1 |
| VECTASHIELD Antifade Mounting Medium | vectorlabs | H-1000-10 | https://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium.html |
Referenzen
- Friedman, S. L., Pinzani, M. Hepatic fibrosis: 2022 unmet needs and a blueprint for the future. Hepatology. 75 (2), 473-488 (2021).
- Ye, Q., et al. Global prevalence, incidence, and outcomes of non-obese or lean non-alcoholic fatty liver disease: A systematic review and meta-analysis. The Lancet Gastroenterology and Hepatology. 5 (8), 739-752 (2020).
- Schwabe, R. F., Tabas, I., Pajvani, U. B. Mechanisms of fibrosis development in non-alcoholic steatohepatitis. Gastroenterology. 158 (7), 1913-1928 (2020).
- Arteel, G. E., Naba, A. The liver matrisome – looking beyond collagens. JHEP Reports. 2 (4), 100115 (2020).
- Jiang, J. X., et al. Nonphagocytic activation of NOX2 is implicated in progressive non-alcoholic steatohepatitis during aging. Hepatology. 72 (4), 1204-1218 (2020).
- Dehnad, A., et al. AGER1 downregulation associates with fibrosis in non-alcoholic steatohepatitis and type 2 diabetes. Journal of Clinical Investigation. 130 (8), 4320-4330 (2020).
- Mayorca-Guiliani, A. E., et al. Decellularization and antibody staining of mouse tissues to map native extracellular matrix structures in 3D. Nature Protocols. 14 (12), 3395-3425 (2019).
- Mazza, G., et al. Cirrhotic human liver extracellular matrix 3D scaffolds promote smad-dependent tgf-beta1 epithelial mesenchymal transition. Cells. 9 (1), 83 (2019).
- Klaas, M., et al. The alterations in the extracellular matrix composition guide the repair of damaged liver tissue. Scientific Reports. 6, 27398 (2016).
- Mattei, G., et al. Mechanostructure and composition of highly reproducible decellularized liver matrices. Acta Biomaterialia. 10 (2), 875-882 (2014).
- Ren, H., et al. Evaluation of two decellularization methods in the development of a whole-organ decellularized rat liver scaffold. Liver International. 33 (3), 448-458 (2013).
- Piersma, B., Hayward, M. K., Weaver, V. M. Fibrosis and cancer: A strained relationship. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1873 (2), 188356 (2020).
- Cox, T. R. The matrix in cancer. Nature Reviews Cancer. 21 (4), 217-238 (2021).
- Mirdamadi, E. S., Kalhori, D., Zakeri, N., Azarpira, N., Solati-Hashjin, M. Liver tissue engineering as an emerging alternative for liver disease treatment. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (2), 145-163 (2020).
- Mazza, G., et al. Decellularized human liver as a natural 3D-scaffold for liver bioengineering and transplantation. Scientific Reports. 5, 13079 (2015).
- Jia, Z., et al. 3D culture system for liver tissue mimicking hepatic plates for improvement of human hepatocyte (C3A) function and polarity. BioMed Research International. 2020, 6354183 (2020).
- Shimoda, H., et al. Decellularized liver scaffolds promote liver regeneration after partial hepatectomy. Scientific Reports. 9 (1), 12543 (2019).
