从小鼠垂体中开发类器官作为 体外 模型以探索垂体干细胞生物学
Summary
垂体是人体内分泌系统的关键调节因子。本文描述了从小鼠垂体中开发类器官作为一种新的3D 体外 模型，以研究腺体的干细胞群，其中的生物学和功能仍然知之甚少。
Abstract
垂体是调节关键生理过程的主要内分泌腺体，包括身体生长、新陈代谢、性成熟、繁殖和应激反应。十多年前，干细胞在垂体中被鉴定出来。然而，尽管转基因 体内 方法的应用，其表型，生物学和作用仍然不清楚。为了解决这个谜团，开发了一种新的创新类器官 体外 模型，以深入揭示垂体干细胞生物学。类器官代表3D细胞结构，在定义的培养条件下，从组织的（上皮）干细胞自我发育，并概括这些干细胞及其组织的多个特征。这里显示，小鼠垂体来源的类器官从腺体的干细胞发育而来，并忠实地概括了它们在 体内 的表型和功能特征。其中，它们将干细胞的活化状态再现为 体内 发生的，以响应转基因造成的局部损伤。类器官可长期扩张，同时强健地保留其茎性表型。新的研究模型对于破译干细胞在垂体重塑的关键条件下的表型和行为非常有价值，从新生儿成熟到衰老相关的褪色，从健康到患病的腺体。在这里，提出了一个详细的方案来建立小鼠垂体衍生的类器官，这为潜入垂体干细胞的神秘世界提供了一个强大的工具。
Introduction
垂体是位于大脑底部的一个微小的内分泌腺体，在那里它与下丘脑相连。腺体整合外周和中枢（下丘脑）输入以产生调谐和协调的激素释放，从而调节下游目标内分泌器官（如肾上腺和性腺），以便在适当的时间产生适当的激素。垂体是内分泌系统的关键调节器，因此被正确地称为主腺体1。
小鼠垂体由三个叶组成（图1），即前叶（AL），中间叶（IL）和后叶（PL）。主要的内分泌AL含有五种激素细胞类型，包括产生生长激素（GH）的生长激素;产生催乳素（PRL）的乳酸营养素;分泌促肾上腺皮质激素（ACTH）的促肾上腺皮质激素;促甲状腺激素负责促甲状腺激素（TSH）的产生;和促性腺激素，使黄体生成素（LH）和卵泡刺激素（FSH）。PL由来自下丘脑的轴突组成，其中储存了催产素和血管加压素（抗利尿激素）激素。IL 位于 AL 和 PL 之间，含有产生黑素细胞刺激素 （MSH） 的黑色素营养体。在人垂体中，IL在发育过程中消退，黑色素营养体在AL1内扩散。除了内分泌细胞外，垂体还含有一组干细胞，基本上由转录因子SOX2 2，3，4，5，6标记。这些SOX2 +细胞位于边缘区（MZ），裂隙的上皮衬里（AL和IL之间的胚胎残余腔），或作为簇分布在AL的实质上，从而在腺体中提出两个干细胞位（图1）2，3，4，5，6。
鉴于垂体不可或缺的性质，腺体功能障碍与严重的并发症有关。垂体功能亢进（以一种或多种激素分泌过多为特征）和垂体功能减退（一种或多种激素的产生缺陷或缺失）可由垂体神经内分泌肿瘤（PitNET;例如，产生 ACTH 的肿瘤导致库欣病）或遗传缺陷（例如，生长激素缺乏导致侏儒症）引起7。此外，垂体手术（例如，切除肿瘤）、感染（例如，下丘脑-垂体结核，或细菌性脑膜炎或脑炎后感染）、希恩综合征（由于分娩时大量失血导致血流不足而坏死）、垂体卒中和创伤性脑损伤是垂体功能减退的其他重要原因8.已经表明，小鼠垂体具有再生能力，能够修复由内分泌细胞的转基因消融引起的局部损伤9，10。SOX2+ 干细胞对所受损伤产生急性反应，表现出活化的表型，其特征是增殖增强（导致干细胞扩增）和干细胞相关因子和途径（例如WNT/NOTCH）表达增加。此外，干细胞开始表达消融的激素，最终导致在接下来的（5至6）个月9，10中大量恢复耗尽的细胞群。此外，在腺体的新生儿成熟阶段（出生后的前3周），垂体干细胞在活化状态下茁壮成长6，11，12，13，而生物体衰老与 原位 干细胞功能下降有关，这是由于衰老时炎症（微）环境增加（或“炎症”）10，14.此外，腺体中的肿瘤发生也与干细胞活化7，15有关。虽然在几种垂体重塑情况下已经检测到干细胞活化（在7，16中综述），但潜在的机制尚不清楚。由于 体内 方法（例如转基因小鼠的谱系追踪）尚未提供垂体干细胞的清晰或全面图像，因此开发可靠的 体外 模型以探索正常和患病垂体中的干细胞生物学至关重要。原代垂体干细胞的标准 体外 培养仍然不足，因为生长能力非常有限，非生理（2D）条件可快速丧失表型（有关更详细的概述，请参见16）。3D球体培养物（垂体）已从垂体干细胞中建立，这些干细胞由侧群和SOX2 + 表型2，3，4鉴定。皮体从干细胞克隆生长，表达干细胞标志物并显示出分化能力，进入内分泌细胞类型。然而，它们并没有显着扩展，而仅显示出有限的可传递性（2-3个段落）3，4。在50%稀释的基质胶中培养1周时，也从未解离的垂体干细胞簇中获得球状结构，但未显示可膨胀性17。皮体球法主要用作干细胞数的读出工具，但进一步的应用受到膨胀能力较差的限制16。
为了解决和克服这些缺点，最近建立了一种新的3D模型，即类器官，从含有MZ和实质干细胞的小鼠的主要内分泌AL开始。已经证明，类器官确实来自垂体的干细胞，并忠实地概括了它们的表型18。此外，类器官是长期可膨胀的，同时有力地保持其干性。因此，它们为扩增原代垂体干细胞提供了一种可靠的方法，以进行深入的探索。这种探索是无法用从垂体中分离出的有限数量的干细胞来实现的，这些干细胞在2D条件下也是不可扩增的16。已经证明，类器官是发现新的垂体干细胞特征（可转化为 体内）的有价值和可靠的工具14，18。重要的是，类器官模型忠实地反映了在局部组织损伤和新生儿成熟期间发生的垂体干细胞活化状态，显示出增强的形成效率和复制上调的分子途径14，18。因此，垂体衍生的类器官模型是一种创新而强大的垂体干细胞生物学研究模型，也是一种干细胞活化读出工具。
该协议详细描述了小鼠垂体衍生类器官的建立。为此，将AL分离并解离成单个细胞，这些细胞嵌入在细胞外基质模拟基质基质（以下简称ECM）中。然后将细胞 – ECM组装在定义的培养基中培养，该培养基基本上含有干细胞生长因子和垂体胚胎调节剂（进一步称为“垂体类器官培养基”（PitOM）18; 表 1）。一旦类器官完全发育（10-14天后），它们可以通过序贯传代进一步扩大槽，并进行广泛的下游探索（例如，免疫荧光，RT-qPCR和本体或单细胞转录组学; 图 1）。从长远来看，预计垂体干细胞类器官将为组织修复方法和再生医学铺平道路。
Protocol
Representative Results
Discussion
如本文所述，AL衍生的类器官代表了 在体外 研究垂体干细胞的强大研究模型。目前，这种类器官方法是可靠和健壮地生长和扩增原代垂体干细胞的唯一可用工具。先前已经报道了衍生自胚胎干细胞（ESC）或诱导多能干细胞（iPSC）的垂体类器官模型，其密切概括了垂体胚胎器官发生23;然而，尽管对研究垂体发育或模拟垂体疾病23，24</…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了鲁汶大学研究基金和法兰德斯科学研究基金（FWO）的资助。E.L.（11A3320N）和C.N.（1S14218N）由FWO / FWO-SB的博士奖学金支持。
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
Referenzen
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