Ontwikkeling van organoïden uit muizenpluipcel als in vitro model om hypofyse stamcelbiologie te verkennen
Summary
De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem van het lichaam. Dit artikel beschrijft de ontwikkeling van organoïden uit de hypofyse van de muis als een nieuw 3D in vitro model om de stamcelpopulatie van de klier te bestuderen waarvan de biologie en functie slecht begrepen blijven.
Abstract
De hypofyse is de belangrijkste endocriene klier die belangrijke fysiologische processen reguleert, waaronder lichaamsgroei, metabolisme, seksuele rijping, voortplanting en stressrespons. Meer dan tien jaar geleden werden stamcellen geïdentificeerd in de hypofyse. Ondanks de toepassing van transgene in vivo benaderingen blijven hun fenotype, biologie en rol echter onduidelijk. Om dit raadsel aan te pakken, wordt een nieuw en innovatief organoïde in vitro model ontwikkeld om de hypofysestamcelbiologie diep te ontrafelen. Organoïden vertegenwoordigen 3D-celstructuren die, onder gedefinieerde kweekomstandigheden, zichzelf ontwikkelen uit de (epitheliale) stamcellen van een weefsel en meerdere kenmerken van die stamcellen en hun weefsel samenvatten. Hier wordt aangetoond dat van hypofyse afgeleide organoïden van muizen zich ontwikkelen uit de stamcellen van de klier en hun in vivo fenotypische en functionele kenmerken getrouw samenvatten. Ze reproduceren onder andere de activeringstoestand van de stamcellen als in vivo optredend als reactie op transgeen toegebrachte lokale schade. De organoïden zijn langdurig uitbreidbaar met behoud van hun stengelfenotype. Het nieuwe onderzoeksmodel is zeer waardevol om het fenotype en gedrag van de stamcellen te ontcijferen tijdens belangrijke omstandigheden van hypofyseremodellering, variërend van neonatale rijping tot verouderingsgerelateerde vervaging en van gezonde tot zieke klieren. Hier wordt een gedetailleerd protocol gepresenteerd om van hypofyse afgeleide organoïden van muizen vast te stellen, die een krachtig hulpmiddel bieden om in de nog raadselachtige wereld van hypofysestamcellen te duiken.
Introduction
De hypofyse is een kleine endocriene klier aan de basis van de hersenen, waar het is verbonden met de hypothalamus. De klier integreert perifere en centrale (hypothalamische) inputs om een afgestemde en gecoördineerde hormoonafgifte te genereren, waardoor stroomafwaartse doel endocriene organen (zoals bijnieren en geslachtsklieren) worden gereguleerd voor het produceren van geschikte hormonen op het juiste moment. De hypofyse is de belangrijkste regulator van het endocriene systeem en wordt daarom met recht de meesterklier1 genoemd.
De hypofyse van de muis bestaat uit drie lobben (figuur 1), d.w.z. de voorkwab (AL), de tussenkwab (IL) en de achterkwab (PL). De belangrijkste endocriene AL bevat vijf hormonale celtypen, waaronder somatotropen die groeihormoon (GH) produceren; lactotropen die prolactine (PRL) genereren; corticotropen die adrenocorticotroop hormoon (ACTH) afscheiden; thyrotropen die verantwoordelijk zijn voor de productie van schildklierstimulerend hormoon (TSH); en gonadotrofen die luteïniserend hormoon (LH) en follikelstimulerend hormoon (FSH) maken. De PL bestaat uit axonale projecties van de hypothalamus waarin de hormonen oxytocine en vasopressine (antidiuretisch hormoon) zijn opgeslagen. De IL bevindt zich tussen de AL en PL en herbergt melanotropen die melanocytstimulerend hormoon (MSH) produceren. In de menselijke hypofyse gaat de IL achteruit tijdens de ontwikkeling en worden melanotropen verspreid binnen de AL1. Naast de endocriene cellen bevat de hypofyse ook een pool van stamcellen, in wezen gekenmerkt door de transcriptiefactor SOX2 2,3,4,5,6. Deze SOX2+-cellen bevinden zich in de marginale zone (MZ), de epitheelbekleding van de spleet (een embryonaal restlumen tussen de AL en IL), of zijn als clusters verspreid over het parenchym van de AL, waardoor twee stamcelniches in de klier worden voorgesteld (figuur 1)2,3,4,5,6.
Gezien de onmisbare aard van de hypofyse, wordt slecht functioneren van de klier geassocieerd met ernstige morbiditeit. Hyperpituïtarisme (gekenmerkt door oversecretie van een of meer hormonen) en hypopituïtarisme (defecte of ontbrekende productie van een of meer hormonen) kunnen worden veroorzaakt door hypofyse neuro-endocriene tumoren (PitNETs; bijv. ACTH-producerende tumoren die leiden tot de ziekte van Cushing) of door genetische defecten (bijv. GH-deficiëntie resulterend in dwerggroei)7. Daarnaast zijn hypofysechirurgie (bijvoorbeeld om tumoren te verwijderen), infecties (bijv. Hypothalamus-hypofysetuberculose of infecties na bacteriële meningitis of encefalitis), het syndroom van Sheehan (necrose vanwege onvoldoende bloedstroom als gevolg van zwaar bloedverlies bij de geboorte), hypofyse-apoplexie en traumatisch hersenletsel andere belangrijke oorzaken van hypofysehypofunctie8 . Het is aangetoond dat de hypofyse van de muis het regeneratieve vermogen bezit en in staat is om lokale schade te herstellen die wordt geïntroduceerd door transgene ablatie van endocriene cellen 9,10. De SOX2+ stamcellen reageren acuut op de toegebrachte verwonding met een geactiveerd fenotype, gekenmerkt door verhoogde proliferatie (resulterend in stamcelexpansie) en verhoogde expressie van stamgerelateerde factoren en routes (bijv. WNT / NOTCH). Bovendien beginnen de stamcellen het geableerde hormoon tot expressie te brengen, wat uiteindelijk resulteert in een aanzienlijk herstel van de uitgeputte celpopulatie gedurende de volgende (5 tot 6) maanden 9,10. Ook tijdens de neonatale rijpingsfase van de klier (de eerste 3 weken na de geboorte) gedijen de hypofysestamcellen in een geactiveerde toestand 6,11,12,13, terwijl organismale veroudering geassocieerd is met verminderde in situ stamcelfunctionaliteit, als gevolg van een toenemende inflammatoire (micro-) omgeving bij veroudering (of ‘ontsteken’)10,14 . Bovendien is tumorigenese in de klier ook geassocieerd met stamcelactivering 7,15. Hoewel stamcelactivering is gedetecteerd in verschillende situaties van hypofyseremodellering (beoordeeld in 7,16), blijven de onderliggende mechanismen onduidelijk. Aangezien in vivo benaderingen (zoals het traceren van afstamming bij transgene muizen) geen duidelijk of volledig beeld van hypofysestamcellen hebben opgeleverd, is de ontwikkeling van betrouwbare in vitro modellen om stamcelbiologie in normale en zieke hypofyse te onderzoeken essentieel. Standaard in vitro kweek van primaire hypofysestamcellen blijft ontoereikend vanwege de zeer beperkte groeicapaciteit en niet-fysiologische (2D) omstandigheden met snel verlies van fenotype (voor een meer gedetailleerd overzicht, zie16). 3D-bolculturen (pituisferen) zijn vastgesteld uit hypofysestamcellen zoals geïdentificeerd door zijpopulatie en SOX2+ fenotype 2,3,4. De pituisferen groeien klonaal uit de stamcellen, drukken stammarkers uit en vertonen differentiatievermogen in de endocriene celtypen. Ze breiden zich echter niet aanzienlijk uit terwijl ze slechts een beperkte doorgang vertonen (2-3 passages)3,4. Bolachtige structuren werden ook verkregen uit niet-gedissocieerde hypofyse stamcelclusters wanneer gekweekt in 50% verdund Matrigel gedurende 1 week, maar de uitbreidbaarheid werd niet aangetoond17. De pituisfeerbenadering wordt meestal gebruikt als uitleesmiddel voor stamcelaantallen, maar verdere toepassingen worden beperkt door inferieure expansiecapaciteit16.
Om deze tekortkomingen aan te pakken en te overwinnen, is onlangs een nieuw 3D-model vastgesteld, d.w.z. organoïden, uitgaande van de belangrijkste endocriene AL van muizen die de MZ en parenchymale stamcellen bevatten. Het is aangetoond dat de organoïden inderdaad zijn afgeleid van de stamcellen van de hypofyse en hun fenotype18 getrouw samenvatten. Bovendien zijn de organoïden op lange termijn uitbreidbaar, terwijl ze hun stengelachtigheid robuust behouden. Daarom bieden ze een betrouwbare methode om primaire hypofysestamcellen uit te breiden voor diepgaande verkenning. Een dergelijke exploratie is niet haalbaar met het beperkte aantal stamcellen dat uit een hypofyse kan worden geïsoleerd, die ook niet uitbreidbaar zijn in 2D-omstandigheden16. Het is aangetoond dat de organoïden waardevolle en betrouwbare hulpmiddelen zijn om nieuwe hypofysestamcelkenmerken te ontdekken (vertaalbaar naar in vivo)14,18. Belangrijk is dat het organoïde model de hypofysestamcelactiveringsstatus getrouw weerspiegelt als optredend tijdens lokale weefselbeschadiging en neonatale rijping, met verbeterde vormingsefficiëntie en replicerende upregulated moleculaire routes14,18. Vandaar dat het van hypofyse afgeleide organoïdemodel een innovatief en krachtig hypofysestamcelbiologisch onderzoeksmodel is, evenals een hulpmiddel voor het uitlezen van stamcelactivering.
Dit protocol beschrijft in detail de vestiging van van hypofyse afgeleide organoïden van muizen. Om dit doel wordt de AL geïsoleerd en gedissocieerd in afzonderlijke cellen, die zijn ingebed in extracellulair matrix-nabootsend Matrigel (hierna ECM genoemd). De cel-ECM-assemblage wordt vervolgens gekweekt in een gedefinieerd medium, dat in wezen stamcelgroeifactoren en hypofyse-embryonale regulatoren bevat (verder aangeduid als ‘hypofyseorganoïde medium’ (PitOM)18; Tabel 1). Zodra de organoïden volledig zijn ontwikkeld (na 10-14 dagen), kunnen ze verder worden uitgebreid door sequentiële passaging en worden onderworpen aan uitgebreide downstream-exploratie (bijv. Immunofluorescentie, RT-qPCR en bulk- of eencellige transcriptomica; Figuur 1). Op de langere termijn wordt verwacht dat de hypofysestamcelorganoïden de weg vrijmaken voor weefselherstelbenaderingen en regeneratieve geneeskunde.
Protocol
Representative Results
Discussion
De al-afgeleide organoïden, zoals hier beschreven, vertegenwoordigen een krachtig onderzoeksmodel om hypofysestamcellen in vitro te bestuderen. Op dit moment is deze organoïde benadering het enige beschikbare hulpmiddel om op betrouwbare en robuuste wijze primaire hypofysestamcellen te laten groeien en uit te breiden. Eerder is een hypofyse-organoïdemodel afgeleid van embryonale stamcellen (ESC) of geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSC) gemeld, dat de hypofyse-embryonale organogenese nauw samenvat<sup …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door subsidies van het KU Leuven Research Fund en het Fonds voor Wetenschappelijk Onderzoek (FWO) – Vlaanderen. E.L. (11A3320N) en C.N. (1S14218N) worden ondersteund door een Ph.D. Fellowship van het FWO/FWO-SB.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
Referenzen
- Melmed, S. . The pituitary. 3rd ed. , 1 (2011).
- Chen, J., et al. The adult pituitary contains a cell population displaying stem/progenitor cell and early-embryonic characteristics. Endocrinology. 146 (9), 3985-3998 (2005).
- Chen, J., et al. Pituitary progenitor cells tracked down by side population dissection. Stem Cells. 27 (5), 1182-1195 (2009).
- Fauquier, T., Rizzoti, K., Dattani, M., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C. A. F. SOX2-expressing progenitor cells generate all of the major cell types in the adult mouse pituitary gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (8), 2907-2912 (2008).
- Rizzoti, K., Akiyama, H., Lovell-Badge, R. Mobilized adult pituitary stem cells contribute to endocrine regeneration in response to physiological demand. Cell Stem Cell. 13 (4), 419-432 (2013).
- Andoniadou, C. L., et al. Sox2+ stem/progenitor cells in the adult mouse pituitary support organ homeostasis and have tumor-inducing potential. Cell Stem Cell. 13 (4), 433-445 (2013).
- Nys, C., Vankelecom, H. Pituitary disease and recovery: How are stem cells involved. Molecular and Cellular Endocrinology. 525 (4), 111176 (2021).
- Schneider, H. J., Aimaretti, G., Kreitschmann-Andermahr, I., Stalla, G. K., Ghigo, E. Hypopituitarism. Lancet. 369 (9571), 1461-1470 (2007).
- Fu, Q., et al. The adult pituitary shows stem/progenitor cell activation in response to injury and is capable of regeneration. Endocrinology. 153 (7), 3224-3235 (2012).
- Willems, C., et al. Regeneration in the pituitary after cell-ablation injury: time-related aspects and molecular analysis. Endocrinology. 157 (2), 705-721 (2016).
- Gremeaux, L., Fu, Q., Chen, J., Vankelecom, H. Activated phenotype of the pituitary stem/progenitor cell compartment during the early-postnatal maturation phase of the gland. Stem Cells and Development. 21 (5), 801-813 (2012).
- Zhu, X., Tollkuhn, J., Taylor, H., Rosenfeld, M. G. Notch-dependent pituitary SOX2+ stem cells exhibit a timed functional extinction in regulation of the postnatal gland. Stem Cell Reports. 5 (6), 1196-1209 (2015).
- Russell, J. P., et al. Pituitary stem cells produce paracrine WNT signals to control the expansion of their descendant progenitor cells. eLife. 10 (1), 59142 (2021).
- Vennekens, A., et al. Interleukin-6 is an activator of pituitary stem cells upon local damage, a competence quenched in the aging gland. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (25), 2100052118 (2021).
- Mertens, F., et al. Pituitary tumors contain a side population with tumor stem cell-associated characteristics. Endocrine-Related Cancer. 22 (4), 481-504 (2015).
- Laporte, E., Vennekens, A., Vankelecom, H. Pituitary remodeling throughout life: are resident stem cells involved. Frontiers in Endocrinology. 11 (1), 604519 (2021).
- Yoshida, S., et al. Isolation of adult pituitary stem/progenitor cell clusters located in the parenchyma of the rat anterior lobe. Stem Cell Research. 17 (2), 318-329 (2016).
- Cox, B., et al. Organoids from pituitary as novel research model to study pituitary stem cell biology. Journal of Endocrinology. 240 (2), 287-308 (2019).
- Denef, C., Hautekeete, E., De Wolf, A., Vanderschueren, B. Pituitary basophils from immature male and female rats: distribution of gonadotrophs and thyrotrophs as studied by unit gravity sedimentation. Endocrinology. 130 (3), 724-735 (1978).
- Vander Schueren, B., Denef, C., Cassiman, J. J. Ultrastructural and functional characteristics of rat pituitary cell aggregates. Endocrinology. 110 (2), 513-523 (1982).
- Claes, C., et al. Human stem cell-derived monocytes and microglia-like cells reveal impaired amyloid plaque clearance upon heterozygous or homozygous loss of TREM2. Alzheimer’s and Dementia. 15 (3), 453-464 (2019).
- Trompeter, H. -. I., et al. MicroRNAs miR-26a, miR-26b, and miR-29b accelerate osteogenic differentiation of unrestricted somatic stem cells from human cord blood. BMC Genomics. 14, 111 (2013).
- Suga, H., et al. Self-formation of functional adenohypophysis in three-dimensional culture. Nature. 480 (7375), 57-62 (2011).
- Matsumoto, R., et al. Congenital pituitary hypoplasia model demonstrates hypothalamic OTX2 regulation of pituitary progenitor cells. Journal of Clinical Investigation. 130 (2), 641-654 (2019).
- Kanie, K., et al. Pathogenesis of anti-PIT-1 antibody syndrome: PIT-1 presentation by HLA class I on anterior pituitary cells. Journal of the Endocrine Society. 3 (11), 1969-1978 (2019).
- Lee, S. H., et al. Tumor evolution and drug response in patient-derived organoid models of bladder cancer. Cell. 173 (2), 515-528 (2018).
- Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).
- Nolan, L. A., Kavanagh, E., Lightman, S. L., Levy, A. Anterior pituitary cell population control: basal cell turnover and the effects of adrenalectomy and dexamethasone treatment. Journal of Neuroendocrinology. 10 (3), 207-215 (1998).
