Bacteriële beweeglijkheid visualiseren op basis van een kleurreactie
Summary
Hier presenteren we een protocol om bacteriële motiliteit te detecteren op basis van een kleurreactie. De belangrijkste voordelen van deze methode zijn dat deze gemakkelijk te evalueren en nauwkeuriger is en geen gespecialiseerde apparatuur vereist.
Abstract
Bacteriële motiliteit is cruciaal voor bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie. Bacteriële beweeglijkheid is cruciaal voor de invasie en/of verspreiding van vele pathogene soorten. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof, pH en temperatuur, kunnen de bacteriegroei en de expressie van bacteriële flagellen beïnvloeden. Dit kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van motiliteit, wat resulteert in de onnauwkeurige evaluatie van bacteriële motiliteit. Op basis van de kleurreactie van 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) door intracellulaire dehydrogenasen van levende bacteriën, werd TTC toegevoegd aan traditionele semisolid agar voor bacteriële motiliteitsdetectie. De resultaten toonden aan dat deze TTC semisolid agar-methode voor de detectie van bacteriële motiliteit eenvoudig is, gemakkelijk te bedienen en geen grote en dure instrumenten omvat. De resultaten toonden ook aan dat de hoogste beweeglijkheid werd waargenomen in halfvast medium bereid met 0,3% agar. In vergelijking met het traditionele semisolid medium zijn de resultaten gemakkelijker te evalueren en nauwkeuriger.
Introduction
Bacteriële motiliteit speelt een cruciale rol bij bacteriële pathogeniciteit, biofilmvorming en medicijnresistentie1. Bacteriële motiliteit is nauw verbonden met pathogeniciteit en is noodzakelijk voor bacteriële kolonisatie tijdens vroege infectie van gastheercellen2. Biofilmvorming is nauw verwant aan bacteriële motiliteit, waarbij bacteriën zich door beweeglijkheid hechten aan het oppervlak van vaste media. Bacteriële motiliteit wordt al lang beschouwd als positief gecorreleerd met biofilmvorming. Een hoge mate van bacteriële resistentie tegen geneesmiddelen als gevolg van biofilm kan leiden tot aanhoudende infecties die een bedreiging vormen voor de menselijke gezondheid 3,4,5. Daarom is het belangrijk om bacteriële beweeglijkheid te detecteren. De bacteriële motiliteitstest wordt voornamelijk gebruikt om de beweeglijkheid van verschillende vormen van bacteriën in de levende toestand te onderzoeken, die indirect de aan- of afwezigheid van flagellen kunnen bepalen en dus een belangrijke rol spelen bij de identificatie van bacteriën.
Er zijn directe en indirecte methoden om bacteriële motiliteitte detecteren 6. Omdat bacteriën met flagella beweeglijkheid vertonen, is het mogelijk om te detecteren of bacteriën indirect beweeglijk zijn door de aan- of afwezigheid van flagella te detecteren. Het is bijvoorbeeld mogelijk om beweeglijkheid indirect te detecteren door elektronenmicroscopie en flagellaire kleuring om aan te geven dat bacteriën beweeglijk zijn. Het is ook mogelijk om te detecteren met directe methoden, zoals suspensieval en semisolid punctiemethoden.
De semisolid punctiemethode die vaak wordt gebruikt in niet-gegradueerde microbiologische laboratoria om bacteriële motiliteit te detecteren, ent de bacteriën in de punctie in het semisolid agar-medium met 0,4-0,8% agar, afhankelijk van de richting van bacteriële groei. Als de bacteriën langs de punctielijn groeien om zich te verspreiden, verschijnen er wolkachtige (borstelachtige) groeisporen, wat wijst op de aanwezigheid van flagella en dus beweeglijkheid. Als er geen groeisporen van de priklijn zijn, is de bacterie niet gevlagd of beweeglijk.
Deze methode heeft echter zijn nadelen: de bacteriën zijn kleurloos en transparant, de flagellaire activiteit wordt beïnvloed door de fysiologische kenmerken van de levende bacteriën en andere factoren, en de concentratie van agar en de kleine diameter van de reageerbuis. Bovendien zijn aërobe bacteriën alleen geschikt voor groei op het agaroppervlak, wat de observatie van bacteriële beweeglijkheid beïnvloedt. Om dit experiment te verbeteren, werd daarom 2,3,5-trifenyltetrazoliumchloride (TTC) (kleurloos) aan het medium toegevoegd om een betrouwbaardere en intuïtievere methode voor het bepalen van bacteriële motiliteit vast te stellen dan de huidige directe punctiemethode met behulp van intracellulaire dehydrogenasen om de vorming van een rood product van TTC 7,8,9,10 te katalyseren.
Protocol
Representative Results
Discussion
De detectie van bacteriële motiliteit door de semisolid medium-methode wordt beïnvloed door vele factoren13,14. Bacteriële groeiomstandigheden, zoals zuurstof (aeroob op agaroppervlak, niet-aeroob aan de onderkant van de buis met het halfvaste medium), pH en temperatuur, kunnen de levensvatbaarheid van bacteriële flagellen beïnvloeden, wat kan leiden tot verminderde beweeglijkheid of zelfs verlies van beweeglijkheid15. Bovendien kunne…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door de Priority Academic Program Development of Jiangsu Higher Education Institutions (PAPD) en het Teaching Reform Research Project van de China Pharmaceutical University (2019XJYB18).
Materials
| Bacto Agar | Difco | ||
| Escherichia coli | ATCC | ATCC25922 | Positive control |
| Pseudomonas aeruginosa | ATCC | ATCC27853 | Positive control |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | Positive control |
| Staphylococcus aureus | ATCC | ATCC25923 | Negative nonmotile control |
| Tryptose | OXOID | ||
| TTC | Sigma | 298-96-4 | |
| VITEK 2 automated microbial identification system | Bio Mérieux |
Referenzen
- Jordan, E. O., Caldwell, M. E., Reiter, D. Bacterial motility. Journal of Bacteriology. 27 (2), 165 (1934).
- Lai, S. L., Hou, H., Jiang, W. Bacterial motility and its role during initial stage of pathogenesis. Journal of Microbiology. 26 (5), 68-70 (2006).
- Ding, S. S., Wang, Y. Relationship between flagella-dependent motility and biofilm in bacteria – A review. Acta Microbiologica Sinica. 49 (4), 417-422 (2009).
- Zeng, J., Wang, D. Recent advances in the mechanism of bacterial resistance and tolerance. Chinese Journal of Antibiotics. 45 (2), 113-121 (2020).
- Xu, M., Zhou, M. X., Zhu, G. Q. Progress in the mechanism of bacterial flagellum motility, adhesion and immune escape. Chinese Journal of Veterinary Science. 37 (2), 369-375 (2017).
- Leboffe, M. J., Pierce, B. E. . Microbiology: laboratory theory and application. Third edition. , (2015).
- Ball, R. J., Sellers, W. Improved motility medium. Applied Microbiology. 14, 670-673 (1966).
- An, S., Wu, J., Zhang, L. H. Modulation of Pseudomonas aeruginosa biofilm dispersal by a cyclic-di-GMP phosphodiesterase with a putative hypoxia-sensing domain. Applied and Environmental Microbiology. 76 (24), 8160-8173 (2010).
- Chouhan, O. P., et al. Effect of site-directed mutagenesis at the GGEEF domain of the biofilm forming GGEEF protein from Vibrio cholerae. AMB Express. 6 (1), 2 (2016).
- McLaughlin, M. R. Simple colorimetric microplate test of phage lysis in Salmonella enterica. Journal of Microbiological Methods. 69 (2), 394-398 (2007).
- Difco Laboratories. Difco manual: Dehydrated culture media and reagents for microbiology. Difco Laboratories. , (1984).
- Tittsler, R. P., Sandholzer, L. A. The use of semi-solid agar for the detection of bacterial motility. Journal of Bacteriology. 31 (6), 575 (1936).
- Qian, Y., Tian, X. Y., Zhang, S. Y., Wang, J. Explore the influencing factors of bacterial motility. Health Care Today. 6, 50-51 (2018).
- Wang, J., et al. Filamentous Phytophthora pathogens deploy effectors to interfere with bacterial growth and motility. Frontiers in Microbiology. 11, 581511 (2020).
- Kühn, M. J., et al. Spatial arrangement of several flagellins within bacterial flagella improves motility in different environments. Nature Communication. 9 (1), 5369 (2018).
- Mitchell, A. J., Wimpenny, J. W. T. The effects of agar concentration on the growth and morphology of submerged colonies of motile and non-motile bacteria. Journal of Applied Microbiology. 83 (1), 76-84 (2010).
- Xu, A., Zhang, M., Du, W., Wang, D., Ma, L. Z. A molecular mechanism for how sigma factor AlgT and transcriptional regulator AmrZ inhibit twitching motility in Pseudomonas aeruginosa. Environmental Microbiology. 23 (2), 572-587 (2021).
- Bartley, S. N., et al. Attachment and invasion of Neisseria meningitidis to host cells is related to surface hydrophobicity, bacterial cell size and capsule. PLoS One. 8, 55798 (2013).
