Administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’ARNm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés
Summary
Ce protocole décrit des techniques pour isoler les hépatocytes primaires de souris du foie et électroporer CRISPR-Cas9 sous forme de ribonucléoprotéines et d’ARNm afin de perturber un gène cible thérapeutique associé à une maladie métabolique héréditaire du foie. Les méthodes décrites se traduisent par une viabilité élevée et des niveaux élevés de modification des gènes après électroporation.
Abstract
Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour isoler les hépatocytes primaires de souris, suivie d’une administration de CRISPR-Cas9 médiée par électroporation sous forme de ribonucléoprotéines (RNP) et d’ARNm. Les hépatocytes primaires de souris ont été isolés à l’aide d’une méthode de perfusion rétrograde en trois étapes, ce qui a donné des rendements élevés allant jusqu’à 50 × 106 cellules par foie et une viabilité cellulaire de >85%. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour le placage, la coloration et la culture des hépatocytes. Les résultats indiquent que l’électroporation offre une efficacité de transfection élevée de 89%, mesurée par le pourcentage de cellules positives aux protéines fluorescentes vertes (GFP) et une viabilité cellulaire modeste de >35% dans les hépatocytes de souris.
Pour démontrer l’utilité de cette approche, CRISPR-Cas9 ciblant le gène de l’hydroxyphénylpyruvate dioxygénase a été électroporé dans des hépatocytes primaires de souris en tant que preuve de principe de l’édition de gènes pour perturber un gène thérapeutique lié à une maladie métabolique héréditaire (MI) du foie. Une édition sur cible plus élevée de 78 % a été observée pour les RNI par rapport à une efficacité d’édition de 47 % avec l’ARNm. La fonctionnalité des hépatocytes a été évaluée in vitro à l’aide d’un test à l’albumine qui a indiqué que l’administration de CRISPR-Cas9 sous forme d’ARN et d’ARNm entraînait une viabilité cellulaire comparable dans les hépatocytes primaires de souris. Une application prometteuse de ce protocole est la génération de modèles murins pour les maladies génétiques humaines affectant le foie.
Introduction
Les MI du foie sont des troubles génétiques caractérisés par la carence d’une enzyme hépatique cruciale impliquée dans le métabolisme qui conduit à l’accumulation de métabolites toxiques. Sans traitement, les MI du foie entraînent une défaillance d’organe ou une mort prématurée 1,2. La seule option curative pour les patients atteints de MI du foie est la transplantation hépatique orthotopique, qui est limitée en raison de la faible disponibilité des organes de donneurs et des complications du traitement immunosuppresseur après la procédure 3,4. Selon des données récentes recueillies par le Réseau d’approvisionnement et de transplantation d’organes, seulement 40 % à 46 % des patients adultes sur la liste d’attente pour une greffe du foie reçoivent un organe, tandis que 12,3 % de ces patients meurent alors qu’ils sont sur la liste d’attente5. De plus, seulement 5% de toutes les maladies rares du foie ont un traitement approuvé par la FDA6. Il est clair qu’il existe un besoin critique de nouveaux traitements pour les MI du foie. Cependant, des modèles de maladie appropriés sont nécessaires pour développer de nouvelles options thérapeutiques.
La modélisation des maladies humaines à l’aide de systèmes in vitro et in vivo reste un obstacle au développement de thérapies efficaces et à l’étude de la pathologie des MI du foie. Les hépatocytes de patients atteints de maladies hépatiques rares sont difficiles à obtenir7. Les modèles animaux sont essentiels pour développer une compréhension de la pathologie de la maladie et pour tester des stratégies thérapeutiques. Cependant, un obstacle est la génération de modèles à partir d’embryons porteurs de mutations létales. Par exemple, les tentatives de création de modèles murins du syndrome d’Alagille (ALGS) avec des embryons contenant des délétions homozygotes d’une séquence de 5 kb près de l’extrémité 5 du gène Jag1 ont entraîné la mort précoce des embryons8. En outre, la génération de modèles murins par édition de gènes dans des cellules souches embryonnaires peut nécessiter beaucoup de temps et de ressources9. Enfin, des mutations apparaîtront à l’extérieur du tissu ciblé, conduisant à des variables confondantes qui peuvent entraver l’étude de la maladie9. L’édition de gènes somatiques permettrait une édition plus facile dans le tissu hépatique et contournerait les défis associés à la génération de modèles à l’aide de cellules souches embryonnaires.
L’électroporation permet l’administration de CRISPR-Cas9 directement dans le noyau en appliquant des courants à haute tension pour perméabiliser la membrane cellulaire et est compatible avec de nombreux types de cellules, y compris celles qui sont intransigeantes aux techniques de transfection, telles que les cellules souches embryonnaires humaines, les cellules souches pluripotentes et les neurones 10,11,12 . Cependant, la faible viabilité est un inconvénient potentiel de l’électroporation; l’optimisation de la procédure peut produire des niveaux élevés d’administration tout en limitant la toxicité13. Une étude récente démontre la faisabilité de l’électroporation des composants CRISPR-Cas9 dans les hépatocytes primaires de souris et d’humains comme une approche très efficace14. L’électroporation ex vivo dans les hépatocytes a le potentiel d’être appliquée pour générer de nouveaux modèles murins pour les MI humaines du foie.
Ce protocole fournit une procédure détaillée étape par étape pour isoler les hépatocytes de souris du foie et ensuite électroporer CRISPR-Cas9 en tant que complexes RNP, constitués de protéine Cas9 et d’ARN guide unique synthétique (ARNg), ou aRNm Cas9 combinés à l’ARNg pour obtenir des niveaux élevés d’édition de gènes sur cible. En outre, le protocole fournit des méthodes pour quantifier l’efficacité, la viabilité et la fonctionnalité de l’édition de gènes après l’électroporation de CRISPR-Cas9 dans des hépatocytes de souris fraîchement isolés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les étapes décrites dans le protocole d’isolement des hépatocytes sont difficiles et nécessitent une pratique pour la compétence. Il existe plusieurs étapes clés pour l’isolement réussi des hépatocytes du foie. Tout d’abord, une bonne canulation de la veine cave inférieure est essentielle pour une perfusion hépatique complète. L’absence de blanchiment dans le foie après perfusion indique un déplacement du cathéter (tableau 1). La veine cave inférieure (perfusion rétrograde) a ét…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RNC a reçu un financement du South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Subvention pilote soutenue par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des National Institutes of Health, l’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation et l’American Society of Gene & Cell Therapy sous les numéros de subvention P30 GM131959, 2021000920, et 2022000099, respectivement. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de l’American Society of Gene & Cell Therapy ou de l’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Le schéma de la figure 1 a été créé avec BioRender.com.
Materials
| Equipment | |||
| 0.2 mL PCR 8-tube FLEX-FREE strip, attached clear flat caps, natural | USA Scientific | 1402-4700 | |
| 6-well Collagen Plates | Advanced Biomatrix | 5073 | |
| accuSpin Micro 17R | Fisher Scientific | 13-100-675 | |
| All-in-one Fluorescent Microscope | Keyence | BZ-X810 | |
| Analog Vortex Mixer | VWR | 97043-562 | |
| ART Wide BORE filtered tips 1,000 µL | ThermoFisher Scientific | 2079GPK | |
| Automated Cell Counter | Bio-Rad Laboratories | TC20 | |
| Blue Wax Dissection Tray | Braintree Scientific Inc. | DTW1 | 9" x 6.5" x 1/2"+F21 |
| Cell scraper/lifter | Argos Technologies | UX-04396-53 | Non-pyrogenic, sterile |
| Conical tubes (15 mL) | Fisher Scientific | 339650 | |
| Conical tubes (50 mL) | Fisher Scientific | 14-432-22 | |
| Cotton applicators | Fisher Scientific | 22-363-170 | |
| Curved scissors | Cooper Surgical | 62131 | |
| Disposable Petri Dishes | Falcon | 351029 | 100mm,sterile |
| Disposable Petri Dishes | VWR | 25373-100 | 35mm, sterile |
| Epoch Microplate Spectrophotometer | BioTek Instruments | 250082 | |
| Falcon Cell strainer (70 µm) | Fisher Scientific | 08-771-2 | |
| Forceps | Cooper Surgical | 61864 | Euro-Med Adson Tissue Forceps |
| IV catheters | BD | 382612 | 24 G x 0.75 in |
| IV infusion set | Baxter | 2C6401 | |
| MyFuge 12 Mini Centrifuge | Benchmark Scientific | 1220P38 | |
| Needles | Fisher Scientific | 05-561-20 | 25 G |
| Nucleofector 2b Device | Lonza | AAB-1001 | Program T-028 was used for electroporation in mouse hepatocytes |
| Peristaltic Pump | Masterflex | HV-77120-42 | 10 to 60 rpm; 90 to 260 VAC |
| Precision pump tubing | Masterflex | HV-96410-14 | 25 ft, silicone |
| Primaria Culture Plates | Corning Life Sciences | 353846 | Nitrogen-containing tissue culture plates |
| Serological Pipets (25 mL) | Fisher Scientific | 12-567-604 | |
| Syringes | BD | 329464 | 1 mL, sterile |
| T100 Thermal Cycler | Bio-Rad Laboratories | 1861096 | |
| Water bath | ALT | 27577 | Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2.5 L |
| Reagents | |||
| Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3 | IDT | 1081058 | |
| Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL | Fisher Scientific | NC9959336 | |
| CleanCap Cas9 mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7606-100 | |
| CleanCap EGFP mRNA | Trilink Biotechnologies | L-7201-100 | |
| Corning Matrigel Matrix | Corning Life Sciences | 356234 | |
| DMEM | ThermoFisher Scientific | 11885076 | Low glucose, pyruvate |
| Ethanol 70% | VWR | 71001-652 | |
| Fetal bovine serum | Thermoscientific | 26140-079 | |
| Hepatocyte Maintenance Medium (MM) | Lonza | MM250 | |
| Hepatocyte Plating Medium (PM) | Lonza | MP100 | |
| Mouse Albumin ELISA Kit | Fisher Scientific | NC0010653 | |
| Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit | Lonza | VPL-1004 | |
| OneTaq HotStart DNA Polymerase | New England Biolabs | M0481L | |
| PBS 10x pH 7.4 | Thermoscientific | 70011-044 | No calcium or magnesium chloride |
| Percoll (PVP solution) | Santa Cruz Biotechnology | sc-500790A | |
| Periodic acid | Sigma-Aldrich | P7875-25G | |
| Permount Mounting Medium | VWR | 100496-550 | |
| QuickExtract DNA Extraction Solution | Lucigen Corporation | QE05090 | |
| Schiff’s fuchsin-sulfite reagent | Sigma-Aldrich | S5133 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | Phenol red |
| Vybrant MTT Cell Viability Assay | ThermoFisher Scientific | V13154 | |
| Perfusion Solution 1 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| EBSS | Fisher Scientific | 14155063 | Complete to 200 mL |
| EGTA (0.5 M) | Bioworld | 40520008-1 | 200 µL |
| HEPES (pH 7.3, 1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| Perfusion Solution 2 (pH 7.4, filter sterilized) | Stable at 4 °C for 2 months | ||
| CaCl2·2H20 (1.8 mM) | Sigma | C7902-500G | 360 µL of 1 M stock |
| EBSS (no calcium, no magnesium, no phenol red) | Fisher Scientific | 14-155-063 | Complete to 200 mL |
| HEPES (1 M) | ThermoFisher Scientific | AAJ16924AE | 2 mL |
| MgSO4·7H20 (0.8 mM) | Sigma | 30391-25G | 160 µL of 1 M stock |
| Perfusion Solution 3 | Prepared fresh prior to use | ||
| Solution 2 | 50 mL | ||
| Liberase | Roche | 5401127001 | 0.094 Wunsch units/mL |
| Mouse Anesthetic Cocktail | |||
| Acepromzine | 0.25 mg/mL final concentration | ||
| Ketamine | 7.5 mg/mL final concentration | ||
| Xylazine | 1.5 mg/mL final concentration | ||
| Software | URL | ||
| Benchling | https://www.benchling.com/ | ||
| ImageJ | https://imagej.nih.gov/ij/ | ||
| TIDE: Tracking of Indels by Decomposition | https://tide.nki.nl/ |
Referenzen
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