Контактная гиперчувствительность как мышиная модель аллергического контактного дерматита

Summary

Контактная гиперчувствительность (СГС) является мышиной экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (АКД). CHS основан на сенсибилизации реактивным гаптеном путем окрашивания бритой кожи грудной клетки и живота, с последующим вызовом кожи уха с разбавленным гаптеном, вызывая реакцию отека, которая оценивается различными способами.

Abstract

Контактная гиперчувствительность (CHS) является экспериментальной моделью аллергического контактного дерматита (ACD), которая может быть изучена на мышах. Это исследование направлено на представление объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами. Чтобы индуцировать CHS, в день «0» мышей сенсибилизировали на ранее выбритом месте путем окрашивания брюшной кожи гаптеном 2,4,6-тринитрохлорбензолом (TNCB) в смеси ацетона-этанола, тогда как отрицательные контрольные мыши были фиктивно сенсибилизированы смесью транспортного средства-ацетона-этанола. На день «4» базовую толщину уха измеряли микрометром до выявления CHS (вызова) путем окрашивания обоих ушей разбавленным TNCB как в тестовой, так и в контрольной группах. Через 24 ч отек уха измеряли микрометром. CHS является примером Опосредованного Т-клетками иммунного ответа, который вызывает отек в воспаленной ткани, достигая пика через 24 ч после того, как кожа бросает вызов с тем же гаптеном. Увеличение отека уха коррелировало с увеличением веса уха, активностью миелопероксидазы (МПО), провоспалительной концентрацией цитокинов в экстрактах уха, повышенным утолщением отечной дермы при гистологическом исследовании и проницаемостью сосудов уха. Также наблюдалось увеличение концентрации TNP-специфических антител IgG1 в сыворотках тестовой группы по сравнению с контрольными мышами. Кроме того, CHS может быть успешно передан с CHS-эффекторными клетками, полученными от доноров, ранее сенсибилизированных TNCB. CHS-эффекторные клетки вводили внутривенно наивным мышам-реципиентам, которым впоследствии бросали вызов тем же разбавленным гаптеном. Отек уха измеряли микрометром через 24 часа.

Introduction

Аллергический контактный дерматит (ACD) является распространенным воспалительным заболеванием кожи в промышленно развитых странах, вызванным реакцией гиперчувствительности IV типа, возникающей в результате воздействия низкомолекулярных химических веществ, называемых гаптенами. Вещества, вызывающие контактную сенсибилизацию у людей, включают ионы тяжелых металлов (хром, никель, железо, кобальт), скипидар, ароматизаторы, красители и консерванты, присутствующие в косметике (например,-фенилендиамин), некоторые лекарства (например, неомицин, бензокаин), β-лактамные антибиотики (т.е. пенициллин), химические вещества, производимые растениями (пентадекакатехол, вещество, присутствующее в ядовитом плюще), а также гидрохинон, используемый в фотографической промышленности ^1,2 . Этиологические агенты ACD очень высоки, так как более 100 000 химических веществ используются только в промышленности, и 2000 новых синтезируются каждый год. На сегодняшний день идентифицировано более 3 700 молекул, которые могут быть контактными гаптенами/аллергенами³. Реакция контактной гиперчувствительности (CHS) представляет собой экспериментальную модель ACD, которая может быть изучена на мышах, морских свинках и крысах и может быть индуцирована местным применением в кожу реактивных химических гаптенов, растворенных в органических растворителях ^4,5,6. Это исследование направлено на описание объективного лабораторного метода, который может помочь изучить реакцию CHS у мышей, которая может быть измерена и количественно определена различными тестами.

CHS состоит из фаз сенсибилизации (индукции) и эффекторной (вызов). На животных моделях гаптены сначала связываются ковалентно с белками в организме для создания неоантигенов. Во время фазы сенсибилизации активированные кератиноциты способствуют миграции и созреванию дендритных клеток кожи (sDC), продуцируя провоспалительные цитокины-фактор некроза опухоли α (TNF-α) и интерлейкин 1β (IL-1β)⁷. Эпидермальные клетки Лангерганса (LC) представляют антигены во время индукционной и эффекторной фаз^{CHS 8}. ЛК, подвергающиеся воздействию гаптена во время сенсибилизации, способствуют индукции как регуляторных, так и эффекторных клеток⁹. Растущие данные нескольких исследований свидетельствуют о том, что ответы CHS могут быть опосредованы либо CD4 + MHC клетками Th1 класса II, локально высвобождающими интерферон-γ (IFN-γ) для использования характерного воспалительного инфильтрата, CD8 ⁺ MHC класса I-ограниченных лимфоцитов Tc1, которые также могут высвобождать IFN-γ но в основном опосредуют цитотоксическое повреждение кератиноцитов, а теперь также интерлейкин 17 (IL-17), продуцирующие клетки Th17^{10, 11.}

Разработано несколько различных моделей CHS, использующих различные виды^{1 2,13,14} и гаптены (подробное сравнение различных гаптенов, растворителей и времени применения обобщено в таблице 1). Мышь, часто используемый лабораторный вид, предлагает несколько преимуществ в изучении CHS. Среди мышей больше штаммов, нокаутов (КО) и трансгенных животных по сравнению с другими видами, что делает их очень привлекательным животным¹⁵. Кроме того, модель CHS требует много животных, и мыши здесь более экономичны. Животные модели не имитируют ACD во всех аспектах; в частности, они показывают корку и шелушение, что не характерно для человека ^16,17. Признаки хронического заболевания сложно воспроизвести, главным образом потому, что описанная модель не предполагает применения гаптена в течение длительного периода времени. Однако здесь было подтверждено, что многие из важных аспектов ACD воспроизводятся. Также было показано, что, как и у человека, эти особенности связаны с местными аллергическими реакциями. Выбор гаптена, его растворителя и его применение, изложенное в этом протоколе, были продиктованы тем фактом, что результаты были подтверждены многочисленными тестами in vitro и что он был протестирован и модифицирован в лаборатории в течение многих лет, пока не была установлена текущая версия. Мышиные модели позволяют анализировать подмножества клеток или цитокины, которые участвуют в развитии ACD и необходимы для доклинических оценок новых методов лечения.

Protocol

Все эксперименты, представленные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами 1-го Местного этического комитета по испытаниям на животных в Кракове. Все описанные процедуры были выполнены в соответствии с местными рекомендациями, особенно в отношении использ…

Representative Results

Для индукции CHS животных сенсибилизировали с помощью окраски кожи (брюшной полости) 150 мкл 5% TNCB или фиктивной сенсибилизации только с помощью транспортного средства. На день «4» реакции на отек ушей обоих ушей были вызваны контактной покраской (вызов) 10 мкл 0,4% TNCB у обеих мышей, ранее ?…

Discussion

CHS индуцируется через гаптены, которые связываются с собственными белковыми антигенами в коже, создавая неоантигены. CHS опосредован локальным внесосудистым рекрутированием циркулирующих антиген-специфических CHS-эффекторных Т-клеток, что приводит к отеку в проблемной ткани, дости…

Materials

70% ethanol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	65350-M	for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655101	for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	179124
Aluminum foil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z185140
Analytical balance	Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany	PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor	MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India	MTP-E-212	automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)	Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA	BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	553441
BSA (bovine serum albumine)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	A9418	protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm	BIOLOGIX, China	15-1070	suitable for 50 mL tubes
Coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-1583	24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	14190144	no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	6522	mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight	Animalab, Poznan, Poland	11251-10FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent	Animalab, Poznan, Poland	11272-50FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,086	polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,094	polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.07017
Ethanol 96%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.59010
Evans blue	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	E2129
FBS (fetal bovine serum)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT501128
Formamide 99.5% (GC)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F7503
Freezer -20 °C	Bosch, Germany	GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C	Bosch, Germany	KGV36V10	mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449	Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism	GraphPad Software Inc.	v. 9.4.0
Grey soap	Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland	Bialy jelen soap bar	grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.60313
Harris hematoxylin solution	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HHS16
Hemocytometer	VWR, Avantor, U.S.A	612-5719	manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H5882
Homogenizer	QIAGEN Hilden, Germany	Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234	homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA	SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H1009
Incubator Heracell 150i	Thermo Electron LED Gmbh, Germany	41071068	37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection	Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland	cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05108
Laboratory Centrifuge	Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany	B00013899	speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge	Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany	75002425	speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	111-0917	for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice	Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland	CBA/J, C57BL/6
Micrometer	Mitutoyo, Tokyo, Japan	193-111	digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655061	with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives	Leica Microsystems CMS GmbH, Germany	DM1000, 294011-082007	histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S9390
Olive-oil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	75343	pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555138
Ortho-dianisine dihydrochloride	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D3252
Paraffin wax	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	76242	beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	20012027	pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter	Elmetron, Poland	CP-401
Pipettes, variable volume with tips	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	EP3123000900-1EA	3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	PERS94-0462	scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome	MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK	HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp	Animalab, Poznan, Poland	14060-10FST	Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27056	black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer	BioTek Instruments, U.S.A	201446	universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S6141	e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm	Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA	33-36
Surgical scissors	Animalab, Poznan, Poland	52138-46	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z672122	tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)	Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan	C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)	Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA	T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	78510
Tubes 15 mL sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430055 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430290 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tween 20	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27173	for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath	AJL Electronic, Poland	LW102
Wax (paraffin) dispenser	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection	Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland	cat.# not avaliable
Xylene (histological grade)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	534056