Hypersensibilité de contact comme modèle murin de dermatite de contact allergique

Summary

L’hypersensibilité de contact (SHC) est un modèle expérimental murin de dermatite de contact allergique (DCA). Le SHC est basé sur la sensibilisation à l’haptène réactif en peignant la peau rasée de la poitrine et de l’abdomen, avec un défi cutané ultérieur de l’oreille avec un haptène dilué, provoquant une réaction de gonflement qui est évaluée de diverses manières.

Abstract

L’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de dermatite de contact allergique (DCA) qui peut être étudié chez la souris. Cette étude vise à présenter une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests. Pour induire le SHC, le jour « 0 », les souris ont été sensibilisées sur une tache précédemment rasée par peinture de la peau abdominale avec le 2,4,6-trinitrochlorobenzène (TNCB) haptène dans un mélange acétone-éthanol, tandis que les souris témoins négatives ont été sensibilisées avec un mélange véhicule seul-acétone-éthanol. Le jour « 4 », l’épaisseur de base de l’oreille a été mesurée avec un micromètre avant l’élicitation du SHC (défi) en peignant les deux oreilles avec de la TNCB diluée à la fois dans les groupes d’essai et témoin. Après 24 h, le gonflement de l’oreille a été mesuré avec un micromètre. Le SHC est un exemple de réponse immunitaire médiée par les lymphocytes T qui provoque un gonflement des tissus enflammés, culminant 24 heures après le défi cutané avec le même haptène. Une augmentation de l’œdème de l’oreille était corrélée à une augmentation du poids de l’oreille, à l’activité de la myéloperoxydase (MPO), à la concentration de cytokines pro-inflammatoires dans les extraits de l’oreille, à l’augmentation de l’épaississement du derme œdémateux lors de l’examen histologique et à la perméabilité vasculaire de l’oreille. Il y avait également une augmentation de la concentration d’anticorps IgG1 spécifiques du TNP dans le sérum du groupe test par rapport aux souris témoins. De plus, le SHC peut être transféré avec succès avec les cellules effectrices du SHC obtenues auprès de donneurs préalablement sensibilisés à la BNTN. Les cellules effectrices du SHC ont été administrées par voie intraveineuse à des souris receveuses naïves, qui ont ensuite été confrontées au même haptène dilué. L’enflure de l’oreille a été mesurée avec un micromètre 24 heures plus tard.

Introduction

La dermatite de contact allergique (DCA) est une maladie inflammatoire cutanée courante dans les pays industrialisés causée par une réaction d’hypersensibilité de type IV résultant de l’exposition à des produits chimiques de faible poids moléculaire appelés haptènes. Les substances qui provoquent la sensibilisation au contact chez l’homme comprennent les ions de métaux lourds (chrome, nickel, fer, cobalt), la térébenthine, les parfums, les colorants et les agents de conservation présents dans les cosmétiques (p. ex., p-phénylènediamine), certains médicaments (p. ex., néomycine, benzocaïne), les antibiotiques β-lactamine (p. ex., pénicilline), les produits chimiques produits par les plantes (pentadécacatéchol, une substance présente dans l’herbe à puce), ainsi que l’hydroquinone utilisée dans l’industrie photographique ^1,2 . Les agents étiologiques ACD sont très élevés car plus de 100 000 produits chimiques sont utilisés dans l’industrie seulement, et 2 000 nouveaux sont synthétisés chaque année. À ce jour, plus de 3 700 molécules pouvant être des haptènes/allergènes de contact ont été identifiées³. La réaction d’hypersensibilité de contact (CHS) est un modèle expérimental de DCA qui peut être étudié chez la souris, les cobayes et les rats et peut être induit par l’application cutanée topique d’haptènes chimiques réactifs dissous dans des solvants organiques ^4,5,6. Cette étude vise à décrire une méthode de laboratoire objective qui peut aider à étudier la réaction CHS chez la souris, qui peut être mesurée et quantifiée par divers tests.

Le SHC comprend des phases de sensibilisation (induction) et d’effecteur (défi). Dans les modèles animaux, les haptènes se lient d’abord de manière covalente aux protéines du corps pour créer des néoantigènes. Pendant la phase de sensibilisation, les kératinocytes activés favorisent la migration et la maturation des cellules dendritiques cutanées (SDC) en produisant des cytokines pro-inflammatoires-facteur de nécrose tumorale α (TNF-α) et de l’interleukine 1β (IL-1β)⁷. Les cellules de Langerhans épidermiques (LC) présentent des antigènes lors des phases d’induction et d’effecteur^{du SHC 8}. Les LC exposées à l’haptène pendant la sensibilisation favorisent l’induction des cellules régulatrices et effectrices⁹. De plus en plus de preuves provenant de plusieurs études suggèrent que les réponses au SHC peuvent être médiées par des cellules Th1 restreintes au CMH CD4+ de classe II, libérant localement de l’interféron γ (IFN-γ) pour utiliser un infiltrat inflammatoire caractéristique, des lymphocytes Tc1 restreints au CMH CD8⁺ de classe I qui peuvent également libérer des γ d’IFN, mais surtout médier les dommages cytotoxiques aux kératinocytes, et maintenant aussi des cellules Th17 productrices d’interleukine^{17 (IL-17) 10, 11}.

Plusieurs modèles de SHC différents utilisant diverses espèces^{1 2,13,14} et haptènes ont été développés (une comparaison détaillée des différents haptènes, solvants et moments d’application est résumée dans le tableau 1). La souris, une espèce de laboratoire fréquemment utilisée, offre quelques avantages dans l’étude du SHC. Il y a plus de souches, de knockouts (KO) et d’animaux transgéniques chez les souris par rapport aux autres espèces, ce qui en fait un animal très attrayant¹⁵. De plus, le modèle CHS nécessite de nombreux animaux, et les souris sont plus économiques ici. Les modèles animaux n’imitent pas l’ACD dans tous les aspects; en particulier, ils présentent des croûtes et desquamations, ce qui n’est pas courant chez l’homme^16,17. Les caractéristiques de la maladie chronique sont difficiles à reproduire, principalement parce que le modèle décrit ne suppose pas l’application de l’haptène pendant une longue période de temps. Cependant, il a été confirmé ici que de nombreux aspects importants de l’ACD sont reproduits. Il a également été démontré que, comme chez l’homme, ces caractéristiques sont associées à des réactions allergiques locales. Le choix de l’haptène, son solvant et son application décrits dans ce protocole ont été dictés par le fait que les résultats ont été confirmés par de nombreux tests in vitro et qu’il a été testé et modifié en laboratoire pendant de nombreuses années jusqu’à ce que la version actuelle soit établie. Les modèles murins permettent l’analyse des sous-ensembles cellulaires ou des cytokines qui sont impliqués dans le développement de la DCA et sont essentiels pour les évaluations précliniques de nouveaux traitements.

Protocol

Toutes les expériences présentées dans cet article ont été menées selon les directives du 1er Comité local d’éthique sur l’expérimentation animale à Cracovie. Toutes les procédures décrites ont été effectuées conformément aux recommandations locales, en particulier en ce qui concerne l’utilisation de la kétamine / xylazine comme anesthésique, l’utilisation des deux côtés des oreilles pour appliquer la substance / haptène, couper l’oreille et prélever le sang par l’ablation du globe ocula…

Representative Results

Pour l’induction du SHC, les animaux ont été sensibilisés par peinture cutanée (abdominale) avec 150 μL de TNCB à 5 % ou simulés sensibilisés avec le véhicule seul. Le jour « 4 », les réponses de gonflement de l’oreille des deux oreilles ont été induites par peinture de contact (défi) avec 10 μL de 0,4 % de TNCB chez les souris précédemment sensibilisées au TNCB (groupe test) et les souris du groupe témoin (simulacre sensibilisées). Les données présentées montrent que les souris sensi…

Discussion

Le SHC est induit par des haptènes, qui se lient aux antigènes auto-protéiques de la peau, créant des néoantigènes. Le SHC est médié par le recrutement extravasculaire local de lymphocytes T effecteurs CHS spécifiques de l’antigène circulant, ce qui entraîne un gonflement du tissu déficient, culminant 24 heures après l’exposition de la peau secondaire au même haptène⁶. Le gonflement du tissu est principalement causé par l’infiltration de leucocytes et le dépôt de f…

Materials

70% ethanol	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	65350-M	for surface disinfection
96-well flat-bottom plates, polypropylene	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655101	for MPO and Evans blue measurement – plates should be made of polypropylene, that has a lower binding capacity so proteins or DNA will not bind
Acetone (ACS reagent, ≥99.5%)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	179124
Aluminum foil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z185140
Analytical balance	Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Germany	PRACTUM224-1s, 29105177
Automated tissue processor	MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India	MTP-E-212	automatically prepare tissue samples by fixing, dehydrating, clearing, and infiltrating them with paraffin
BD Vacutainer SST II Advance (tube with gel for obtaining serum)	Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, USA	BD 366882
Bicinchoninic acid kit for protein determination	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	BCA1-1KT
Biotin Rat Anti-Mouse IgG1	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	553441
BSA (bovine serum albumine)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	A9418	protein assays & analysis, 2 mg/mL
Cell strainer, pore size 70 μm	BIOLOGIX, China	15-1070	suitable for 50 mL tubes
Coverslip	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-1583	24 mm, but it possible to use different size
Disposable pipettes capacity: 5 mL, 10 mL, 25 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z740301, Z740302, Z740303
DPBS (Dulbecco′s phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	14190144	no calcium, no magnesium, mammalian cell culture
DPX Mountant for histology	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	6522	mounting media for H-E, might be used some other e.g, Canada balsam
Dumont 5 tweezers – straight	Animalab, Poznan, Poland	11251-10FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Dumont 7 tweezers – bent	Animalab, Poznan, Poland	11272-50FST	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Eosin Y solution, alcoholic	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT110116
Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,086	polypropylene
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 2.0 mL	Eppenforf, Germany	3,01,20,094	polypropylene, round bottom (the homogenization beads can easily move)
Ethanol 100% (absolute alkohol)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.07017
Ethanol 96%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.59010
Evans blue	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	E2129
FBS (fetal bovine serum)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	A3160802
Formalin solution, neutral buffered, 10%	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HT501128
Formamide 99.5% (GC)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	F7503
Freezer -20 °C	Bosch, Germany	GSN54AW30
Fridge +4 °C / freezer -20 °C	Bosch, Germany	KGV36V10	mammalian Cell Culture, qualified, Brazil, 10 x 50 mL
Glass microskope slides, SuperFrost Plus	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449	Slides that eliminates the need to apply adhesive materials or protein coatings, to preventing any tissue sections loss during staining.
Graph Pad Prism	GraphPad Software Inc.	v. 9.4.0
Grey soap	Pollena Ostrzeszów, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Poland	Bialy jelen soap bar	grey Soap Bar Natural Hypoallergenic. Generally available product
H2SO4 (sulfuric acid) 1 mol/l (1 M)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.60313
Harris hematoxylin solution	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	HHS16
Hemocytometer	VWR, Avantor, U.S.A	612-5719	manual counting chamber is recommend, which is more accurate
Hexadecyltrimethylammonium bromide	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H5882
Homogenizer	QIAGEN Hilden, Germany	Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234	homogenizer with stainless steel beads (diameter 5 mm) for 2 mL centrifuge tubes
Horseradish peroxidase streptavidin (HRP streptavidin)	Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA	SA-5004-1
Hydrogen peroxide solution (H202)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	H1009
Incubator Heracell 150i	Thermo Electron LED Gmbh, Germany	41071068	37 oC in the atmosphere of 5 % CO2, and 65 0C for deparaffinization the sections for histology
Ketamine 100 mg/mL, solution for injection	Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Poland	cat.# not avaliable
KH2PO4 (potassium dihydrogen phosphate) 99.995% anhydrous basis	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	1.05108
Laboratory Centrifuge	Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Germany	B00013899	speed to 300 x g, with cooling to 4 0C
Laboratory Centrifuge	Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Germany	75002425	speed to 3,000 x g, with cooling to 4 0C
Mask (FFP2)	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	111-0917	for working with ortho-dianisine dihydrochloride
Mice	Breeding unit of the Chair of Biomedical Sciences, Faculty of Health Sciences, Jagiellonian University Medical College, Krakow, Poland	CBA/J, C57BL/6
Micrometer	Mitutoyo, Tokyo, Japan	193-111	digit Outside Micrometer, Ratchet Stop, 0-25mm Range, 0.001mm Graduation, +/-0.002mm Accuracy, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml
microplate, 96 well, microlon, high binding (for ELISA test)	Greiner Bio-One GmbH, Kremsmunster, Austria	655061	with maxi-sorp binding surfaces for reliable and reproducible results in colormetric assays
Microscope with objectives	Leica Microsystems CMS GmbH, Germany	DM1000, 294011-082007	histology presented in the paper was performed under ThermoFisher Scientific EVOS M5000 Imaging System, with objectives: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD and FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD
Myeloperoxidase from human leukocytes (MPO standard)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	M6908
Na2HPO4 x 7 H2O (sodium phosphate dibasic heptahydrate)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S9390
Olive-oil	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	75343	pure, natural
OptEIA Mouse IFN-γ ELISA Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555138
Ortho-dianisine dihydrochloride	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	D3252
Paraffin wax	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	76242	beads, waxy solid
PBS (phosphate buffered saline)	ThermoFisher Scientific,  Waltham, Massachusetts, USA	20012027	pH 7.2, mammalian cell culture
ph meter	Elmetron, Poland	CP-401
Pipettes, variable volume with tips	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	EP3123000900-1EA	3-pack, Option 1, 0.5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, includes epT.I.P.S.
Razor blade	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	PERS94-0462	scraper and cutter blades, single edge, aluminium spine, 100 blades per box, individually wrapped
Rotary microtome	MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK	HIS-202A
Scissors – straight, sharp / sharp	Animalab, Poznan, Poland	14060-10FST	Surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Screw cap (open top)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27056	black polypropylene hole cap, for use with 22 mL vial with 20-400 thread
Spectrophotometer	BioTek Instruments, U.S.A	201446	universal microplate spectrophotometer: λ range: 200 – 999 nm, absorbance measurement range: 0.000 – 4.000 Abs
Staining dish 20 slides with rack	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	S6141	e.g. 20 slide staining dishes complete with covers, slide rack and handle
Sterile Disposable Biopsy Punch 6mm	Integra LifeSciences, Princeton, NJ, USA	33-36
Surgical scissors	Animalab, Poznan, Poland	52138-46	surgical instruments for procedures on mice (should be steriled)
Tissue processing cassettes	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	Z672122	tissue processing/ embedding cassettes with lid
TMB Substrate Reagent Set	Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, USA	555214
TNCB (2,4,6-trinitrochlorobenzene)	Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japan	C0307
TNP-BSA (bovine serum albumin conjugated with 2,4,6-trinitrophenyl)	Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, USA	T-5050
T-PER (tissue protein extration reagent)	ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA	78510
Tubes 15 mL sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430055 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tubes 50 mL, sterile	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	CLS430290 (Corning)	polypropylene, conical bottom
Tween 20	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	P1379
Vials, screw top, clear glass (vial only) 22 mL	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	27173	for the preparation of hapten, screwed on so that it does not evaporate
Water bath	AJL Electronic, Poland	LW102
Wax (paraffin) dispenser	VWR, Radnor, Pennsylvania, United States	114-8737
Xylazine (xylapan 20 mg/mL) solution for injection	Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Poland	cat.# not avaliable
Xylene (histological grade)	Merck KGaA, Darmstadt, Germany	534056