Dit protocol demonstreert het gebruik van een microfluïdisch kanaal met veranderende geometrie langs de vloeistofstroomrichting om extensieve spanning (stretching) te genereren om vezels uit te lijnen in een 3D-collageenhydrogel (< 250 μm dik). De resulterende uitlijning strekt zich uit over enkele millimeters en wordt beïnvloed door de extensieve reksnelheid.
Uitgelijnde collageen I (COL1) vezels begeleiden de motiliteit van tumorcellen, beïnvloeden de morfologie van endotheelcellen, controleren stamceldifferentiatie en zijn een kenmerk van hart- en bewegingsweefsels. Om de celrespons op uitgelijnde micro-omgevingen in vitro te bestuderen, zijn verschillende protocollen ontwikkeld om COL1-matrices te genereren met gedefinieerde vezeluitlijning, waaronder magnetische, mechanische, celgebaseerde en microfluïdische methoden. Hiervan bieden microfluïdische benaderingen geavanceerde mogelijkheden, zoals nauwkeurige controle over vloeistofstromen en de cellulaire micro-omgeving. De microfluïdische benaderingen om uitgelijnde COL1-matrices te genereren voor geavanceerde in vitro kweekplatforms zijn echter beperkt tot dunne “matten” (<40 μm in dikte) van COL1-vezels die zich uitstrekken over afstanden van minder dan 500 μm en niet bevorderlijk zijn voor 3D-celkweektoepassingen. Hier presenteren we een protocol om 3D COL1-matrices (130-250 μm dik) te fabriceren met millimeterschaalgebieden van gedefinieerde vezeluitlijning in een microfluïdisch apparaat. Dit platform biedt geavanceerde celkweekmogelijkheden om gestructureerde weefselmicro-omgevingen te modelleren door directe toegang te bieden tot de micro-engineered matrix voor celkweek.
Cellen bevinden zich in een complex 3D-vezelig netwerk dat de extracellulaire matrix (ECM) wordt genoemd, waarvan het grootste deel bestaat uit het structurele eiwit collageen type I (COL1)1,2. De biofysische eigenschappen van de ECM geven aanwijzingen aan cellen en als reactie daarop hermodelleren cellen de ECM-microarchitectuur 3,4,5. Deze reciproke cel-matrix interacties kunnen aanleiding geven tot uitgelijnde COL1 vezeldomeinen6 die angiogenese en celinvasie in de tumoromgeving 7,8,9 bevorderen en de celmorfologie 10,11,12, polarisatie 13 en differentiatie 14 beïnvloeden. Uitgelijnde collageenvezels bevorderen ook wondgenezing 15, spelen een sleutelrol in weefselontwikkeling16 en dragen bij aan celcommunicatie op lange afstand17,18. Daarom is het repliceren van de inheemse COL1-vezelmicroarchitectuur in vitro een belangrijke stap in de richting van het ontwikkelen van gestructureerde modellen om celreacties op uitgelijnde micro-omgevingen te bestuderen.
Microfluïdische celkweeksystemen zijn vastgesteld als een voorkeurstechnologie om microfysiologische systemen (MPS) te ontwikkelen 19,20,21,22,23. Door gebruik te maken van gunstige schaaleffecten op microschaal, bieden deze systemen nauwkeurige controle over vloeistofstromen, ondersteunen ze de gecontroleerde introductie van mechanische krachten en definiëren ze de biochemische micro-omgeving binnen een microkanaal 21,24,25,26,27. MPS-platforms zijn gebruikt om weefselspecifieke micro-omgevingen te modelleren en multi-orgaaninteracties te bestuderen28. Tegelijkertijd zijn hydrogels op grote schaal onderzocht om de 3D-mechanica en biologische invloed van de ECM die in vivo worden waargenomen samen te vatten 29,30. Met een groeiende nadruk op het integreren van 3D-cultuur met microfluïdische platforms, kunnen tal van benaderingen COL1-hydrogels combineren in microfluïdische apparaten31,32,33. De methoden om COL1-hydrogels in microfluïdische kanalen uit te lijnen, zijn echter beperkt tot dunne 2D-“matten” (<40 μm dik) in kanalen <1 mm breed, met een beperkt potentieel om celresponsen te modelleren in uitgelijnde 3D-micro-omgevingen31,34,35,36.
Om uitgelijnde 3D COL1-hydrogels in een microfluïdisch systeem te bereiken, is aangetoond dat, wanneer een zelfassemblerende COL1-oplossing wordt blootgesteld aan lokale extensieve stromen (snelheidsverandering langs de stroomsgewijze richting), de resulterende COL1-hydrogels een mate van vezeluitlijning vertonen die recht evenredig is met de grootte van de extensieve reksnelheid die ze ervaren37, 38. Het microkanaalontwerp in dit protocol is op twee manieren uniek; ten eerste introduceert het gesegmenteerde ontwerp lokale extensieve spanning in de COL1-oplossing, en ten tweede stelt de “tweedelige” constructie de gebruiker in staat om COL1-vezels uit te lijnen en vervolgens het kanaal te demonteren om rechtstreeks toegang te krijgen tot de uitgelijnde vezels in een open formaat. Deze aanpak kan verder worden toegepast om modulaire microfluïdische platforms te ontwikkelen die microfysiologische systemen ontwikkelen met geordende COL1-matrices. Het volgende protocol beschrijft het proces van het fabriceren van gesegmenteerde microkanalen en beschrijft het gebruik van de kanalen om runderatelo COL1 uit te lijnen. Dit protocol biedt ook instructies voor het kweken van cellen op COL1 in een open putformaat en bespreekt het toevoegen van functionaliteit aan het platform met behulp van een modulaire, magnetische basislaag.
Protocollen voor het genereren van COL1-matrices met uitgelijnde vezels zijn beschreven met behulp van magnetische methoden, de directe toepassing van mechanische spanning en microfluïdische technieken47. Microfluïdische benaderingen worden vaak gebruikt om microfysiologische systemen te creëren vanwege hun goed gedefinieerde stroom- en transportkenmerken, die nauwkeurige controle over de biochemische micro-omgeving mogelijk maken. Aangezien uitgelijnde COL1-vezels belangrijke instructieve sign…
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het National Institute of Health onder toekenningsnummer R21GM143658 en door de National Science Foundation onder subsidienummer 2150798. De inhoud is uitsluitend de verantwoordelijkheid van de auteurs en vertegenwoordigt niet noodzakelijkerwijs de officiële standpunten van de financieringsagentschappen.
(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES) | Sigma Aldrich | 440140-100ML | |
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip | Jensen Global | JG-20-1.0-90 | |
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet | KJ Magnetics | D31 | |
3M (TC) 12X12-6-467MP | DigiKey | 3M9726-ND | |
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5% | Signa Aldrich | 179124-4L | |
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER | Electro-Technic Products | 12051A | |
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar | VWR | AAJ64100-09 | |
Clear cast acrylic sheet | McMaster-Carr | 8560K181 | |
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested | VWR | 45000-666 | |
Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | |
CT-FIRE software | LOCI – University of Wisconsin | ||
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL | Lonza | CC-3162 | |
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL | VWR | VWRV0875-100ML | |
Graphtec CELITE-50 | Graphtec | CE LITE-50 | |
HEPES (1 M) | Thermo Fisher Scientific | 15-630-080 | |
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer | McMaster-Carr | 87315K62 | |
Human Umbilical Vein Endothelial cells | Thermo Fisher Scientific | C0035C | |
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%) | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
Isopropanol | Fisher Scientific | A4154 | |
Laser cutter | Full Spectrum | 20×12 H-series | |
Microfluidics Syringe pump | New Era Syringe Pumps | NE-1002X | |
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E | Gilson | FD10006 | |
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | |
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate | Thermo Fisher Scientific | H3570 | |
Nutragen Bovine Atelo Collagen | Advanced BioMatrix | 5010-50ML | |
Pbs (10x), pH 7.4 | VWR | 70011044.00 | |
PBS pH 7.4 | Thermo Fisher Scientific | 10010049.00 | |
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100 | Alfa Aesar | J63521 | |
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20 | USCUTTER | GRPCARSHTN | |
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip | Restek | 22766.00 | |
Silicon wafer | University wafer | 452 | |
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g | VWR | BDH9292-500G | |
Sylgard 184 | VWR | 102092-312 | |
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20 | Thermo Fisher Scientific | 28352.00 |