Hydrogels de collagène 3D Microtechnique avec alignement de fibres à longue portée

Summary

Ce protocole démontre l’utilisation d’un canal microfluidique avec une géométrie changeante le long de la direction d’écoulement du fluide pour générer une déformation d’extension (étirement) afin d’aligner les fibres dans un hydrogel de collagène 3D (<250 μm d’épaisseur). L’alignement résultant s’étend sur plusieurs millimètres et est influencé par la vitesse de déformation extensionnelle.

Abstract

Les fibres de collagène I alignées (COL1) guident la motilité des cellules tumorales, influencent la morphologie des cellules endothéliales, contrôlent la différenciation des cellules souches et sont une caractéristique des tissus cardiaques et musculo-squelettiques. Pour étudier la réponse cellulaire aux microenvironnements alignés in vitro, plusieurs protocoles ont été développés pour générer des matrices COL1 avec un alignement défini des fibres, y compris des méthodes magnétiques, mécaniques, cellulaires et microfluidiques. Parmi celles-ci, les approches microfluidiques offrent des capacités avancées telles que le contrôle précis des flux de fluides et du microenvironnement cellulaire. Cependant, les approches microfluidiques pour générer des matrices COL1 alignées pour les plateformes de culture in vitro avancées ont été limitées à de minces « tapis » (<40 μm d’épaisseur) de fibres de COL1 qui s’étendent sur des distances inférieures à 500 μm et ne sont pas propices aux applications de culture cellulaire 3D. Ici, nous présentons un protocole pour fabriquer des matrices COL1 3D (130-250 μm d’épaisseur) avec des régions millimétriques d’alignement de fibres définies dans un dispositif microfluidique. Cette plate-forme fournit des capacités avancées de culture cellulaire pour modéliser des microenvironnements tissulaires structurés en fournissant un accès direct à la matrice de micro-ingénierie pour la culture cellulaire.

Introduction

Les cellules résident dans un réseau fibreux 3D complexe appelé matrice extracellulaire (ECM), dont la majeure partie est composée de la protéine structurelle collagène de type I (COL1)^1,2. Les propriétés biophysiques de l’ECM fournissent des indices de guidage aux cellules et, en réponse, les cellules remodèlent la microarchitecture ECM ^3,4,5. Ces interactions réciproques cellule-matrice peuvent donner naissance à des domaines fibreux COL1 alignés⁶ qui favorisent l’angiogenèse et l’invasion cellulaire dans l’environnement tumoral ^7,8,9 et influencent la morphologie cellulaire 10,11,12^, la polarisation 13 et la différenciation ¹⁴. Les fibres de collagène alignées favorisent également la cicatrisation des plaies 15, jouent un rôle clé dans le développement des tissus¹⁶ et contribuent à la communication cellulaire à longue distance^17,18. Par conséquent, la réplication in vitro de la microarchitecture native de la fibre COL1 est une étape importante vers le développement de modèles structurés pour étudier les réponses cellulaires aux microenvironnements alignés.

Les systèmes de culture cellulaire microfluidique ont été établis comme une technologie privilégiée pour développer des systèmes microphysiologiques (MPS)19,20,21,22,23. Tirant parti des effets de mise à l’échelle microscopique favorables, ces systèmes fournissent un contrôle précis des écoulements de fluides, soutiennent l’introduction contrôlée de forces mécaniques et définissent le microenvironnement biochimique dans un microcanal 21,24,25,26,27. Les plateformes MPS ont été utilisées pour modéliser des microenvironnements spécifiques aux tissus et étudier les interactions multi-organes²⁸. Simultanément, les hydrogels ont été largement explorés pour récapituler la mécanique 3D et l’influence biologique de l’ECM que l’on observe in vivo^29,30. Avec un accent croissant sur l’intégration de la culture 3D avec des plates-formes microfluidiques, de nombreuses approches peuvent combiner des hydrogels COL1 dans des dispositifs microfluidiques^31,32,33. Cependant, les méthodes d’alignement des hydrogels de COL1 dans les canaux microfluidiques ont été limitées à de minces « tapis » 2D (<40 μm d’épaisseur) dans des canaux de <1 mm de large, offrant un potentiel limité pour modéliser les réponses cellulaires dans des microenvironnements 3D alignés^31,34,35,36.

Pour obtenir des hydrogels COL1 3D alignés dans un système microfluidique, il a été démontré que, lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée est exposée à des flux d’extension locaux (changement de vitesse le long de la direction du cours d’eau), les hydrogels COL1 résultants présentent un degré d’alignement des fibres directement proportionnel à l’ampleur de la vitesse de déformation d’extension^{qu’ils subissent 37, 38}. La conception du microcanal dans ce protocole est unique à deux égards ; premièrement, la conception segmentée introduit une contrainte d’extension locale à la solution COL1, et deuxièmement, sa construction en deux parties permet à l’utilisateur d’aligner les fibres COL1, puis de désassembler le canal pour accéder directement aux fibres alignées dans un format ouvert. Cette approche peut également être adoptée pour développer des plates-formes microfluidiques modulaires qui développent des systèmes microphysiologiques avec des matrices COL1 ordonnées. Le protocole suivant décrit le processus de fabrication de microcanaux segmentés et détaille l’utilisation des canaux pour aligner l’atelo COL1 bovin. Ce protocole fournit également des instructions pour la culture de cellules sur COL1 dans un format de puits ouvert et discute de l’ajout de fonctionnalités à la plate-forme à l’aide d’une couche de base modulaire et magnétique.

Protocol

1. Fabrication du canal en deux parties et de la base de plate-forme modulaire REMARQUE: Le canal microfluidique est construit en deux parties: le canal microfluidique « découpe », qui est coupé au rasoir à partir d’une feuille de polydiméthylsiloxane (PDMS) d’épaisseur définie, et le couvercle du canal, qui se lie de manière réversible à la découpe et forme le canal. Le canal est entouré d’un cadre en poly(méthacrylate de méthyle) (PMMA) qui agira comme u…

Representative Results

Lorsqu’une solution de COL1 auto-assemblée s’écoule dans un canal dont la section transversale diminue, la vitesse du flux (v x) de la solution de COL1 augmente localement d’une magnitude, ∂v x, le long de la constriction entre les deux segments (∂x), ce qui entraîne une vitesse de déformation d’extension (ε̇) où ε̇ = ∂v x/∂x. Le taux de déformation d’extension peut être calculé à partir de la vitesse du fluide, qui est mesurée à l’aide de la vélocimét…

Discussion

Les protocoles de génération de matrices COL1 avec des fibres alignées ont été décrits à l’aide de méthodes magnétiques, de l’application directe de contraintes mécaniques et de techniques microfluidiques⁴⁷. Les approches microfluidiques sont couramment utilisées pour créer des systèmes microphysiologiques en raison de leurs caractéristiques d’écoulement et de transport bien définies, qui permettent un contrôle précis du microenvironnement biochimique. Étant donné que les…

Materials

(3-Aminopropyl)triethoxysilane, 99% (APTES)	Sigma Aldrich	440140-100ML
20 Gauge IT Series Angled Dispensing Tip	Jensen Global	JG-20-1.0-90
3/16" dia. x 1/16" thick Nickel Plated Magnet	KJ Magnetics	D31
3M (TC) 12X12-6-467MP	DigiKey	3M9726-ND
ACETONE ACS REAGENT ≥99.5%	Signa Aldrich	179124-4L
BD-20AC LABORATORY CORONA TREATER	Electro-Technic Products	12051A
Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V, 98%, Reagent Grade, Alfa Aesar	VWR	AAJ64100-09
Clear cast acrylic sheet	McMaster-Carr	8560K181
Corning 100 mL Trypsin 10x, 2.5% Trypsin in HBSS [-] calcium, magnesium, phenol red, Porcine Parvovirus Tested	VWR	45000-666
Countess II Automated Cell Counter	Thermo Fisher Scientific	AMQAX1000
CT-FIRE software	LOCI – University of Wisconsin
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit, (CC-3156 & CC-4176), Lonza CC-3162, 500 mL	Lonza	CC-3162
Glutaraldehyde 50% in aqueous solution, Reagent Grade, Packaging=HDPE Bottle, Size=100 mL	VWR	VWRV0875-100ML
Graphtec CELITE-50	Graphtec	CE LITE-50
HEPES (1 M)	Thermo Fisher Scientific	15-630-080
High-Purity Silicone Rubber .010" Thick, 6" X 8" Sheet, 55A Durometer	McMaster-Carr	87315K62
Human Umbilical Vein Endothelial cells	Thermo Fisher Scientific	C0035C
Invitrogen Trypan Blue Stain (0.4%)	Thermo Fisher Scientific	T10282
Isopropanol	Fisher Scientific	A4154
Laser cutter	Full Spectrum	20×12 H-series
Microfluidics Syringe pump	New Era Syringe Pumps	NE-1002X
Microman E Single Channel Pipettor, Gilson, Model M1000E	Gilson	FD10006
Molecular Probes Alexa Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379
Molecular Probes Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate	Thermo Fisher Scientific	H3570
Nutragen Bovine Atelo Collagen	Advanced BioMatrix	5010-50ML
Pbs (10x), pH 7.4	VWR	70011044.00
PBS pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010049.00
Phosphate-buffered saline (PBS, 10x), with Triton X-100	Alfa Aesar	J63521
Replacement carrier sheet for graphtec craft ROBO CC330L-20	USCUTTER	GRPCARSHTN
Restek Norm-Ject Plastic Syringe 1 mL Luer Slip	Restek	22766.00
Silicon wafer	University wafer	452
Sodium Hydroxide, ACS, Packaging=Poly Bottle, Size=500 g	VWR	BDH9292-500G
Sylgard 184	VWR	102092-312
Thermo Scientific Pierce 20x PBS Tween 20	Thermo Fisher Scientific	28352.00