多形性胶质母细胞瘤的转化原位模型
Summary
在这里，我们描述了GBM的临床前原位小鼠模型，该模型是通过颅内注射源自基因工程小鼠模型肿瘤的细胞而建立的。该模型显示了人类GBM的疾病特征。对于转化研究，通过 体内 MRI和组织病理学跟踪小鼠脑肿瘤。
Abstract
用于人类多形性胶质母细胞瘤（GBM）的基因工程小鼠（GEM）模型对于了解脑肿瘤的发展和进展至关重要。与异种移植肿瘤不同，在GEM中，肿瘤在免疫功能正常的小鼠的天然微环境中出现。然而，由于肿瘤潜伏期长、肿瘤频率异质性以及晚期肿瘤发展的时间，GBM GEMs在临床前治疗研究中的使用具有挑战性。通过颅内原位注射 诱导 的小鼠在临床前研究中更容易处理，并保留了GEM肿瘤的特征。我们生成了一个原位脑肿瘤模型，该模型源自具有Rb，Kras和p53畸变（TRP）的GEM模型，该模型发展为GBM肿瘤，显示肿瘤细胞的线性坏死病灶，以及类似于人类GBM的密集血管化。来自GEM GBM肿瘤的细胞被颅内注射到野生型，品系匹配的受体小鼠中并复制IV级肿瘤，因此绕过了GEM小鼠中较长的肿瘤潜伏期，并允许为临床前研究创建大型且可重复的队列。针对 GBM 的 TRP GEM 模型的高度增殖性、侵袭性和血管特征在原位肿瘤中得到概括，组织病理学标志物反映了人类 GBM 亚组。通过连续MRI扫描监测肿瘤生长。由于免疫功能正常模型中颅内肿瘤的侵袭性，仔细遵循此处概述的注射程序对于防止颅外肿瘤生长至关重要。
Introduction
胶质母细胞瘤（GBM;IV 级胶质瘤）是最常见和恶性的脑肿瘤，目前的治疗方法无效，导致中位生存期为 15 个月1。代表脑肿瘤生长和发病机制所涉及的复杂信号通路的可靠和准确的临床前模型对于加快评估GBM新治疗方案的进展至关重要。将人脑肿瘤细胞系皮下植入免疫功能低下的小鼠小鼠模型不能反映脑肿瘤的天然免疫环境，也不能用于评估治疗药物穿越血脑屏障的能力2。理想情况下，临床前小鼠模型还应密切再现人类GBM组织病理学，包括对周围薄壁3的高度侵入性。尽管基因工程小鼠（GEM）模型在完整的免疫系统背景下发展肿瘤，但通常需要复杂的育种方案，并且肿瘤可能发展缓慢且不一致4。GEM衍生的同种异体移植模型更适合临床前治疗研究，在这些研究中，需要在更短的时间内进行大量荷瘤小鼠。
在之前的报告中，我们描述了一种直接来自GEM肿瘤的原位GBM小鼠模型。GEM中的肿瘤发生是由表达神经胶质原纤维酸性蛋白（GFAP）的细胞群（主要是星形胶质细胞）中的遗传事件引发的，导致进展为GBM。这些TRP GEM含有TgGZT121转基因（T），其在暴露于GFAP驱动的Cre重组酶后表达T121。T121蛋白表达导致Rb（Rb1，p107和p103）蛋白活性的抑制。GFAP驱动的Cre转基因（GFAP-CreERT2）的共表达靶向使用他莫昔芬诱导后对成年星形胶质细胞的表达。TRP小鼠还携带一种依赖克雷的突变体克拉斯（KrasG12D;R）等位基因，代表受体酪氨酸激酶途径的激活，并且是Pten（P）5，6损失的杂合子。受体酪氨酸激酶 （RTK）、PI3K 和 RB 网络中的并发基因畸变与 74% 的 GBM 发病机制有关7。因此，人类GBM中改变的主要信号通路由TRP小鼠的工程突变表示，特别是GBM肿瘤，其中RTK的共同下游靶标被激活5。
GEM衍生的同源原位模型被验证为一种模型，该模型概括了人脑肿瘤的特征，包括侵袭性和亚型生物标志物的存在，可用作评估针对GBM异常途径的癌症治疗的平台。从从TRP脑中收获的肿瘤中培养细胞，并使用立体定向设备在皮层中进行颅内注射，重新植入品系匹配小鼠的大脑中。该临床前原位小鼠模型开发了GBM肿瘤，这些肿瘤具有高度细胞性，侵袭性，多形性，具有高有丝分裂率，并显示出肿瘤细胞坏死和致密血管化的线性病灶，如人类GBM所观察到的那样。通过 体内 磁共振成像（MRI）测量肿瘤体积和生长。
在本报告中，我们以TRP肿瘤为例，描述了将原代GBM细胞或细胞系颅内注射到野生型小鼠大脑中的最佳技术。相同的方案可以适用于免疫功能低下的小鼠和其他GBM细胞系。给出了避免常见陷阱的关键技巧，例如细胞制备欠佳或注射部位的细胞泄漏，以及正确使用立体定向设备以确保模型的可重复性和可靠性。出于转化目的，我们通过MRI检测活体动物脑肿瘤生长，组织学表征来验证该模型，并提出了荷瘤小鼠的治疗示例。
Protocol
Representative Results
Discussion
临床前模型对于评估GBM的新治疗靶点和新的治疗策略至关重要。用于GBM的基因工程小鼠模型具有肿瘤在本土部位发生的优势，但通常具有较长的潜伏期和不可预测的肿瘤生长13。GEM模型肿瘤表现出4-5个月的潜伏期，成像，募集和治疗的理想时间窗口在个体小鼠之间是可变的。原位模型具有4-5周的成熟且易于处理的生长和治疗时间表，并且在植入后通过MRI可靠地检测到肿瘤。使用GE…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢艾伦·库拉加先生提供的出色技术援助，感谢米歇尔·古姆普雷希特女士改进外科技术。我们感谢Philip L. Martin博士的病理学分析，以及弗雷德里克国家实验室MRI扫描小动物成像计划的Lilia Ileva女士和Joseph Kalen博士。
该项目全部或部分由美国国立卫生研究院国家癌症研究所的联邦资金资助，合同号为HHSN261201500003I。本出版物的内容不一定反映卫生与公众服务部的观点或政策，提及商品名称、商业产品或组织也不意味着美国政府的认可。
Materials
| 5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved | Millipore Sigma | M7027 | |
| 1mL Tuberculin Syringe, slip tip | BD | 309659 | |
| 6" Cotton Tipped Applicators | Puritan | S-18991 | |
| Adjustable stage platform | David Kopf Instruments | Model 901 | |
| Aerosol Barrier Tips | Fisher Scientific | 02-707-33 | |
| Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch | PDI | C69900 | |
| B6D2 mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J) | Jackson Laboratory | Jax #10006 | |
| Bone Wax | Surgical Specialties | 901 | |
| Bupivacaine 0.25% | Henry Schein | 6023287 | |
| BuprenorphineSR | ZooPharm | n/a | |
| Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD | UDP | T10004001 | |
| CVS Lubricant Eye Ointment | CVS Pharmacy | 247881 | |
| Disposable Scalpels, #10 blade | Scalpel Miltex | 16-63810 | |
| Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box | Somni Scientific | n/a | Investigator may use facility standard equipment |
| Gas anesthesia platform for mice | David Kopf Instruments | Model 923-B | |
| GraphPad Prism | Graphpad | Prism 9 version 9.4.1 | |
| Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3 | Hamilton | Special Order | |
| Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL | Hamilton | 7653-01 | |
| Hot bead sterilizer with beads | Fine Science Tools | 18000-45 | |
| Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter | Fisher Scientific | AMQAX2000 | |
| IsoFlurane | Piramal Critical Care | 29404 | |
| Isopropyl Alcohol Prep Pads | PDI | C69900 | |
| ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present) | Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah | ||
| KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console | David Kopf Instruments | Model 940 | |
| Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID | Masterflex | HV-30616-16 | |
| Mouse Heating Plate | David Kopf Instruments | PH HP-4M | |
| Mouse Rectal Probe | David Kopf Instruments | PH RET-3-ISO | |
| Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors | ThermoFisher Scientific | 74000-00 | |
| P20 pipette | Gilson | F123600 | |
| Povidone Iodine Surgical Scrub | Dynarex | 1415 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Applicator | Fine Science Tools | 12031-09 | |
| Reflex 9 mm Wound Clip Remover | Fine Science Tools | 12033-00 | |
| Reflex 9 mm Wound Clips | Fine Science Tools | 12032-09 | |
| Semken forceps, curved | Fine Science Tools | 11009-13 | |
| Temperature Controller | David Kopf Instruments | PH TCAT-2LV | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip | BD | 309626 | |
| UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller | World Precision Instruments | Model UMP3T |
Referenzen
- Tamimi, A. F., Juweid, M. Epidemiology and Outcome of Glioblastoma. Glioblastoma. , (2017).
- Robertson, F. L., Marques-Torrejon, M. A., Morrison, G. M., Pollard, S. M. Experimental models and tools to tackle glioblastoma. Disease Models & Mechanisms. 12 (9), (2019).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. The New England Journal of Medicine. 359 (5), 492-507 (2008).
- Haddad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- El Meskini, R., et al. A preclinical orthotopic model for glioblastoma recapitulates key features of human tumors and demonstrates sensitivity to a combination of MEK and PI3K pathway inhibitors. Disease Models & Mechanisms. 8 (1), 45-56 (2015).
- Song, Y., et al. Evolutionary etiology of high-grade astrocytomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (44), 17933-17938 (2013).
- Cancer Genome Atlas Research Network. Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways. Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).
- Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103 (10), 1871-1879 (2012).
- Choyke, P. L., Dwyer, A. J., Knopp, M. V. Functional tumor imaging with dynamic contrast-enhanced magnetic resonance imaging. Journal of Magnetic Resonance Imaging. 17 (5), 509-520 (2003).
- Raza, S. M., et al. Identification of necrosis-associated genes in glioblastoma by cDNA microarray analysis. Clinical Cancer Research. 10, 212-221 (2004).
- Raza, S. M., et al. Necrosis and glioblastoma: a friend or a foe? A review and a hypothesis. Neurosurgery. 51 (1), 2-12 (2002).
- Hambardzumyan, D., Bergers, G. Glioblastoma: defining tumor niches. Trends in Cancer. 1 (4), 252-265 (2015).
- Kijima, N., Kanemura, Y. Glioblastoma. Mouse Models of Glioblastoma. , (2017).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PloS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Jin, F., Jin-Lee, H. J., Johnson, A. J. Mouse Models of Experimental Glioblastoma. Gliomas. , (2021).
- Zalles, M., Towner, R. A. Pre-Clinical Models and Potential Novel Therapies for Glioblastomas. Gliomas. , 1-13 (2021).
- Wierzbicki, K., et al. Targeting and therapeutic monitoring of H3K27M-mutant glioma. Current Oncology Reports. 22 (2), 19 (2020).
