Modèles orthotopiques translationnels de glioblastome multiforme

Summary

Ici, nous décrivons un modèle murin orthotopique préclinique pour le GBM, établi par injection intracrânienne de cellules dérivées de tumeurs modèles de souris génétiquement modifiées. Ce modèle présente les caractéristiques de la maladie du GBM humain. Pour les études translationnelles, la tumeur cérébrale de souris est suivie par IRM in vivo et histopathologie.

Abstract

Les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) pour le glioblastome multiforme humain (GBM) sont essentiels pour comprendre le développement et la progression des tumeurs cérébrales. Contrairement aux tumeurs xénogreffées, dans les GEM, les tumeurs apparaissent dans le microenvironnement natif chez une souris immunocompétente. Cependant, l’utilisation des GEM GBM dans les études de traitement précliniques est difficile en raison des longues latences tumorales, de l’hétérogénéité de la fréquence des néoplasmes et du moment du développement tumoral de grade avancé. Les souris induites par injection orthotopique intracrânienne sont plus traitables pour les études précliniques et conservent les caractéristiques des tumeurs GEM. Nous avons généré un modèle orthotopique de tumeur cérébrale dérivé d’un modèle GEM avec aberrations Rb, Kras et p53 (TRP), qui développe des tumeurs GBM présentant des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense analogue au GBM humain. Les cellules dérivées des tumeurs GBM GEM sont injectées par voie intracrânienne dans des souris receveuses de type sauvage et appariées à la souche et reproduisent les tumeurs de grade IV, contournant ainsi la longue période de latence tumorale chez les souris GEM et permettant la création de cohortes importantes et reproductibles pour les études précliniques. Les caractéristiques hautement prolifératives, invasives et vasculaires du modèle TRP GEM pour le GBM sont récapitulées dans les tumeurs orthotopiques, et les marqueurs histopathologiques reflètent les sous-groupes de GBM humains. La croissance tumorale est surveillée par des IRM en série. En raison de la nature invasive des tumeurs intracrâniennes dans les modèles immunocompétents, il est essentiel de suivre attentivement la procédure d’injection décrite ici pour prévenir la croissance tumorale extracrânienne.

Introduction

Le glioblastome (GBM; gliome de grade IV) est la tumeur cérébrale la plus courante et maligne, et les traitements actuels sont inefficaces, entraînant une survie médiane de 15 mois¹. Des modèles précliniques fiables et précis qui représentent les voies de signalisation complexes impliquées dans la croissance des tumeurs cérébrales et la pathogenèse sont essentiels pour accélérer les progrès dans l’évaluation de nouveaux schémas thérapeutiques pour le GBM. Les modèles murins dans lesquels des lignées cellulaires de tumeurs cérébrales humaines sont implantées par voie sous-cutanée chez des souris immunodéprimées ne reflètent pas l’environnement immunitaire natif des tumeurs cérébrales et ne peuvent pas non plus être utilisés pour évaluer la capacité des traitements à traverser la barrière hémato-encéphalique². Idéalement, les modèles murins précliniques devraient également reproduire étroitement l’histopathologie du GBM humain, y compris le niveau élevé d’invasivité dans le parenchyme environnant³. Bien que les modèles de souris génétiquement modifiées (GEM) développent des tumeurs dans le contexte d’un système immunitaire intact, des schémas de sélection compliqués sont souvent nécessaires et les tumeurs peuvent se développer lentement et de manière incohérente⁴. Les modèles d’allogreffe dérivés de GEM sont mieux adaptés aux études thérapeutiques précliniques, où de grandes cohortes de souris porteuses de tumeurs sont nécessaires dans un délai plus court.

Dans un rapport précédent, nous avons décrit un modèle murin orthotopique GBM dérivé directement des tumeurs GEM. La tumorigenèse dans le GEM est initiée par des événements génétiques dans les populations cellulaires (principalement les astrocytes) exprimant la protéine acide fibrillaire gliale (GFAP), qui entraînent une progression vers le GBM. Ces GEM TRP hébergent un transgène TgGZT121 (T), qui exprime T121 après exposition à la Cre recombinase pilotée par GFAP. L’expression de la protéine T121 entraîne la suppression de l’activité des protéines Rb (Rb1, p107 et p103). La co-expression d’un transgène Cre piloté par GFAP (GFAP-CreERT2) cible l’expression aux astrocytes adultes après induction avec le tamoxifène. Les souris TRP hébergent également un Kras mutant dépendant de Cre (Kras^G12D; R) allèle, pour représenter l’activation du récepteur tyrosine kinase voie, et sont hétérozygotes pour la perte de Pten (P)^5,6. Des aberrations génétiques concomitantes dans les réseaux du récepteur tyrosine kinase (RTK), PI3K et RB sont impliquées dans 74% de la pathogenèse GBM⁷. Par conséquent, les principales voies de signalisation altérées dans le GBM humain sont représentées par les mutations modifiées chez les souris TRP, en particulier les tumeurs GBM, dans lesquelles les cibles partagées en aval des RTK sont activées⁵.

Le modèle orthotopique syngénique dérivé de GEM a été validé en tant que modèle récapitulant les caractéristiques des tumeurs cérébrales humaines, y compris le caractère invasif et la présence de biomarqueurs de sous-type, pour une utilisation comme plate-forme pour évaluer les traitements anticancéreux ciblant les voies aberrantes dans le GBM. Les cellules ont été cultivées à partir de tumeurs prélevées dans les cerveaux TRP et réimplantées dans le cerveau de souris appariées à la souche, en utilisant un équipement stéréotaxique pour l’injection intracrânienne dans le cortex. Ce modèle murin orthotopique préclinique a développé des tumeurs GBM hautement cellulaires, invasives, pléomorphes avec un taux mitotique élevé, et présentait des foyers linéaires de nécrose par des cellules néoplasiques et une vascularisation dense, comme observé pour le GBM humain. Les volumes tumoraux et la croissance ont été mesurés par imagerie par résonance magnétique (IRM) in vivo .

Dans ce rapport, nous décrivons la technique optimale pour l’injection intracrânienne de cellules GBM primaires ou de lignées cellulaires dans le cerveau de souris de type sauvage, en utilisant les tumeurs TRP comme exemple. Le même protocole peut être adapté pour les souris immunodéprimées et d’autres lignées cellulaires GBM. Des conseils cruciaux sont donnés pour éviter les pièges courants, tels que la préparation sous-optimale des cellules ou les fuites de cellules au site d’injection, et pour utiliser correctement l’équipement stéréotaxique afin d’assurer la reproductibilité et la fiabilité du modèle. À des fins translationnelles, nous validons le modèle par détection IRM de la croissance des tumeurs cérébrales chez les animaux vivants, la caractérisation histologique, et présentons un exemple de traitement chez des souris porteuses de tumeurs.

Protocol

Le protocole d’étude décrit ici a été approuvé par le NCI au Frederick Animal Care and Use Committee. NCI-Frederick est accrédité par AAALAC International et suit la politique du service de santé publique pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire. Les soins aux animaux ont été fournis conformément aux procédures décrites dans le Guide de soin et d’utilisation des animaux de laboratoire (Conseil national de recherches, 2011; The National Academies Press, Washington D.C.). <p class="jo…

Representative Results

Les souris injectées avec des cellules tumorales cérébrales doivent être surveillées quotidiennement pour détecter des signes de croissance tumorale tels que des convulsions, une ataxie ou une perte de poids. La croissance des tumeurs cérébrales peut également être surveillée par IRM à intervalles réguliers. Les IRM hebdomadaires permettent de visualiser l’augmentation de la charge tumorale dans le cerveau et les mesures du volume tumoral (Figure 1C). En particulier, les tumeu…

Discussion

Les modèles précliniques sont essentiels pour l’évaluation de nouvelles cibles thérapeutiques et de nouvelles stratégies de traitement du GBM. Les modèles murins génétiquement modifiés pour le GBM ont l’avantage de l’apparition de tumeurs dans le site autochtone, mais souvent avec une longue latence et une croissance tumorale imprévisible¹³. Les tumeurs du modèle GEM présentent une latence de 4 à 5 mois, et la fenêtre de temps idéale pour l’imagerie, le recrutement et le tra…

Materials

5% methylcellulose in 1X PBS, autoclaved	Millipore Sigma	M7027
1mL Tuberculin Syringe, slip tip	BD	309659
6" Cotton Tipped Applicators	Puritan	S-18991
Adjustable stage platform	David Kopf Instruments	Model 901
Aerosol Barrier Tips	Fisher Scientific	02-707-33
Alcohol Prep Pads Sterile, Large – 2.5 x 3 Inch	PDI	C69900
B6D2  mouse strain (C57Bl/6J x DBA/2J)	Jackson Laboratory	Jax #10006
Bone Wax	Surgical Specialties	901
Bupivacaine 0.25%	Henry Schein	6023287
BuprenorphineSR	ZooPharm	n/a
Clear Vinyl Tubing 1/8ID X 3/16OD	UDP	T10004001
CVS Lubricant Eye Ointment	CVS Pharmacy	247881
Disposable Scalpels, #10 blade	Scalpel Miltex	16-63810
Gas anesthesia machine with oxygen hook-up and anesthesia box	Somni Scientific	n/a	Investigator may use facility standard equipment
Gas anesthesia platform for mice	David Kopf Instruments	Model 923-B
GraphPad Prism	Graphpad	Prism      9      version 9.4.1
Hamilton 30 g needle, ½ “, small hub, point pst 3	Hamilton	Special Order
Hamilton precision microliter syringe, 1701 RN, no needle 10 µL	Hamilton	7653-01
Hot bead sterilizer with beads	Fine Science Tools	18000-45
Invitrogen Countess 3 Automated Cell Counter	Fisher Scientific	AMQAX2000
IsoFlurane	Piramal Critical Care	29404
Isopropyl Alcohol Prep Pads	PDI	C69900
ITK_SNAP (Version 36.X, 2011-present)	Penn Image Computing and Science Laboratory (PICSL) at the University of Pennsylvania, and the Scientific Computing and Imaging Institute (SCI) at the University of Utah
KOPF Small Animal Stereotaxic Instrument with digital readout console	David Kopf Instruments	Model 940
Masterflex Fitting, PVDF, Straight, Hose Barb Reducer, 1/4" ID x 1/8" ID	Masterflex	HV-30616-16
Mouse Heating Plate	David Kopf Instruments	PH HP-4M
Mouse Rectal Probe	David Kopf Instruments	PH RET-3-ISO
Nalgene Super Versi-Dry Surface Protectors	ThermoFisher Scientific	74000-00
P20 pipette	Gilson	F123600
Povidone Iodine Surgical Scrub	Dynarex	1415
Reflex 9 mm Wound Clip Applicator	Fine Science Tools	12031-09
Reflex 9 mm Wound Clip Remover	Fine Science Tools	12033-00
Reflex 9 mm Wound Clips	Fine Science Tools	12032-09
Semken forceps, curved	Fine Science Tools	11009-13
Temperature Controller	David Kopf Instruments	PH TCAT-2LV
Trypsin-EDTA (0.25%)	ThermoFisher Scientific	25200056
Tuberculin Syringe with 25g needle, slip tip	BD	309626
UltraMicroPump 3 with Micro2T Controller	World Precision Instruments	Model UMP3T