Ex Vivo (생체 외 ) 요로상피세포에서 기계적으로 활성화된Ca2+ 과도 현상 분석
Summary
이 프로토콜은 형광Ca2+ 센서 GCaMP5G를 사용하여 천연 요로상피 세포에서 기계적으로 활성화된 이온 채널의 기능을 평가하는 방법론을 설명합니다.
Abstract
기계적으로 활성화된 이온 채널은 스트레치 또는 전단력과 같은 기계적 자극을 전기 및 생화학적 신호로 변환하는 생물학적 변환기입니다. 포유류에서 기계적으로 활성화된 채널은 촉각 감각, 청각, 적혈구 부피 조절, 기초 혈압 조절 및 방광 충만 감각과 같은 다양한 과정에서 외부 및 내부 자극을 감지하는 데 필수적입니다. 기계적으로 활성화된 이온 채널의 기능은 패치 클램프 기술을 사용하여 시험관 내 설정에서 광범위하게 연구되었지만, 이러한 채널의 발현 부위에 대한 접근이 제한되어 있기 때문에 기본 환경에서 그 기능을 평가하는 것은 여전히 어려운 작업입니다(예: 구심성 말단, 메르켈 세포, 압수용기 및 신장 세뇨관) 또는 패치 클램프 기술 적용의 어려움(예: 요로상피 우산 세포의 정점 표면). 이 프로토콜은 생체 외 요로상피 제제에서 형광 센서 GCaMP5G를 사용하여 기계적으로 유발된 Ca 2+ 과도 현상을 평가하는 절차를 설명하며, 이는 다른 천연 조직 제제에서 기계적으로 유발된 Ca2+ 사건의 연구에 쉽게 적용할 수 있는 기술입니다.
Introduction
요로의 상피 세포는 요로 여과액이 네프론을 통과할 때 기계적 힘을 받고 소변은 신장 골반에서 펌핑되어 요관을 통해 이동하여 방광에 저장됩니다. 요로를 둘러싸고 있는 상피 세포의 체액에 의해 가해지는 기계적 힘(예: 전단 응력 및 스트레치)이 근위 세뇨관의 단백질과 원위 네프론 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11의 용질의 재흡수를 조절한다는 것은 오랫동안 인식되어 왔습니다. 12,13, 방광 및 배뇨에 소변 저장14,15,16,17.
기계적 자극을 전기적 및 생화학적 신호로 변환하는 과정, 즉 메카노트랜스덕션(mechanotransduction)으로 지칭되는 과정은 세포 구조 또는 관련 세포외 기질(18,19,20,21)의 변형에 반응하는 단백질에 의해 매개된다. 기계적으로 활성화된 이온 채널은 막 장력, 압력 또는 전단 응력(18,19,20,21,22)의 변화에 반응하여 폐쇄 상태에서 개방 투과성 상태로 전환한다는 점에서 독특합니다. 또한,Ca2+ 과도현상은 인테그린-매개 기계형질도입 또는 세포-세포 접합부(23,24,25,26)에서의 기계반응성 접착 시스템의 활성화에 의해 개시될 수 있다. 이온 채널 기능은 일반적으로 패치-클램프 기법으로 평가되며, 이는 세포막과 패치 피펫(27) 사이에 기가옴 시일의 형성을 수반한다. 그러나 조밀한 세포외 기질(예: 신장 세뇨관)이 있거나 물리적 장벽(예: 글리코칼릭스)으로 둘러싸인 깊은 조직층에 위치한 세포는 유리 마이크로피펫으로 접근하기 어렵습니다. 마찬가지로, 기계적 안정성이 좋지 않은 조직의 필수적인 부분(예: 요로상피)에 묻혀 있거나 필수적인 세포는 패치 클램프 기술로 쉽게 연구할 수 없습니다. 많은 기계적으로 활성화된 이온 채널이 Ca 2+에 투과되기 때문에, 대안적인 접근법은 Ca2+-민감성 염료 또는 GCaMP와 같은 유전적으로 인코딩된 칼슘 지표 (GECI)를 사용하여 형광 현미경으로 이들의 활성을 평가하는 것이다. 단백질 공학에 대한 최근의 노력은 GECI28,29,30의 동적 범위, 민감도 및 반응을 크게 증가시켰고, 유전학의 발전으로 특정 세포 집단에서 발현이 가능해져 기계 형질도입 연구에 이상적으로 적합하게 되었습니다.
요로 상피(urothelium)는 방광의 내부를 덮고 있는 층상 상피로, 방광 간질로 요로용질이 확산되는 것을 막는 장벽 역할을 할 뿐만 아니라, 방광 충만도를 감지하여 이러한 사건을 기저 신경과 근육계에 전달하는 변환기의 역할도 한다16. 이전 연구에 따르면 요로상피와 하부 조직 사이의 통신에는 기계적으로 활성화된 이온 채널인 Piezo1과 Piezo2가 필요합니다31. 요로상피 세포에서 기계적으로 유도된 Ca2+ 일시적인 현상을 평가하기 위해, 요로상피 세포에서Ca2+ 센서 GCaMP5G를 발현하기 위해 아데노바이러스 유전자 전달을 사용하는 새로운 기술이 개발되었다. 이 기술은 가장 바깥쪽 우산 세포층에 쉽게 접근할 수 있는 점막 시트 준비와 닫힌 유리 마이크로피펫으로 개별 세포를 동시에 기계적 자극하고 시간 경과에 따른 형광 변화를 기록하기 위한 컴퓨터 지원 시스템을 사용합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
모든 유기체, 그리고 겉보기에 대부분의 세포 유형은 기계적 자극에 반응하는 이온 채널을 발현합니다 20,33,34,35,36,37. 이러한 기계적으로 활성화된 채널의 기능은 주로 패치 클램프 기술로 평가되었습니다. 그러나 접근성 문제로 인해 기계적으로 ?…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 NIH 보조금 R01DK119183(GA 및 MDC에) 및 S10OD028596(GA에)과 Pittsburgh Center for Kidney Research(P30DK079307)의 세포 생리학 및 모델 유기체 신장 이미징 코어의 지원을 받았습니다.
Materials
| 20x Objective | Olympus | UMPlanFL N | |
| 24 G ¾” catheter | Medline | Suresite IV slide | |
| 4x Objective | Olympus | UPlanFL N | |
| Analog/digital converter | Molecular Devices | Digidata 1440A | |
| Anti-GFP antibody | Abcam | Ab6556 | |
| Beam splitter | Chroma | T495lpxr | |
| Bipolar temperature controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| CaCl2 | Fluka | 21114-1L | 1 M solution |
| cellSens software | Olympus | Imaging software | |
| CMOS camera | Hamamatsu | ORCA fusion | |
| Donkey anti-rabbit conjugated to Alexa Fluor 488 | Jackson ImmunoResearch | 711-545-152 | |
| Excel | Microsoft Corporation | ||
| Filter | Chroma | ET470/40X | |
| Glass capillaries Corning 8250 glass | Warner Instruments | G85150T-4 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Inline heater | Warner Instruments | SH-27B | |
| KCl | Sigma | 793590 | |
| Light source | Sutter Instruments | Lambda XL | |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-510 | ID 1.52 mm |
| Manifold pump tubing | Fisherbrand | 14-190-533 | ID 2.79 mm |
| MgCl2 | Sigma | M9272 | |
| Mice | Jackson Lab | 664 | 2-4 months old female C57BL/6J |
| Microforge | Narishige | MF-830 | |
| Micromanipulator | Sutter Instruments | MP-285 | |
| Microscope | Olympus | BX51W | |
| Mounting media with DAPI | Invitrogen | S36964 | Slowfade Diamond Antifade with DAPI |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| pClamp software | Molecular Devices | Version 10.4 | Patch-clamp electrophysiology data acquisition and analysis software |
| Peristaltic pump | Gilson | Minipuls 3 | |
| Piezoelectric actuator | Thorlabs | PAS005 | |
| Pipette holder | World Precision Instruments | ||
| Pipette puller | Narishige | PP-830 | |
| Quick exchange heated base with perfusion and adapter ring kit | Warner Instruments | QE-1 | Quick exchange platform fits 35 mm dish |
| Rhodamine-phalloidin | Invitrogen | R415 | |
| Sigma-Plot | Systat Software Inc | Version 14.0 | Scientific graphing and data analysis software |
| Silicone elastomer | Dow | Sylgard 184 | |
| Single channel open-loop piezo controller | Thorlabs | MDT694B | |
| Square grid holder pad | Ted Pella | 10520 | |
| Suture | AD Surgical | S-S618R13 | 6-0 Sylk |
| Teflon mounting rod | Custom made | Use to mount the piezoelectric actuator in the micromanipulator | |
| Tubing | Fisher Scientific | 14171129 | Tygon S3 ID 1/16 IN, OD 1/8 IN |
| USB Digital I/O device | National Instruments | NI USB-6501 |
Referenzen
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