여기에 제시된 것은 mechano-node-pore sensing (mechano-NPS)라고하는 전자 기반 미세 유체 플랫폼을 사용하여 단일 세포를 기계적으로 표현형하는 방법입니다. 이 플랫폼은 1-10 cells/s의 적당한 처리량을 유지하면서 세포의 탄성 및 점성 생물물리학적 특성을 모두 측정합니다.
세포의 기계적 특성은 줄기 세포 분화에서 암 전이에 이르기까지 다양한 생물학적 과정과 질병에 관여합니다. 원자력 현미경 (AFM) 및 마이크로 피펫 흡인 (MA)과 같은 이러한 특성을 측정하는 기존의 방법은 세포의 전체 점탄성 반응을 반영하여 풍부한 정보를 캡처합니다. 그러나 이러한 방법은 처리량이 매우 낮기 때문에 제한됩니다. 실시간 변형성 세포분석(RT-DC)과 같은 고처리량 접근 방식은 종종 세포의 탄성 특성만 반영하는 단일 파라미터 판독값으로 제한되기 때문에 제한된 기계적 정보만 측정할 수 있습니다. 이러한 방법과 달리 메카노-노드-기공 감지(mechano-NPS)는 중간 처리량으로 세포의 다중 파라미터 점탄성 측정을 달성하는 데 있어 격차를 해소하는 유연하고 비표지 미세유체 플랫폼입니다. 직류(DC) 측정은 세포가 미세유체 채널을 통과할 때 세포를 모니터링하여 좁은 수축을 통과하기 전, 도중 및 후에 세포의 크기와 속도를 추적하는 데 사용됩니다. 이 정보(즉, 크기 및 속도)는 각 셀의 횡방향 변형, 변형에 대한 저항 및 변형으로부터의 회복을 정량화하는 데 사용됩니다. 일반적으로이 전자 기반 미세 유체 플랫폼은 여러 점탄성 세포 특성을 제공하므로 세포의 기계적 상태를보다 완벽하게 파악할 수 있습니다. 최소한의 샘플 준비가 필요하고 간단한 전자 측정(고속 카메라와 달리)을 활용하며 표준 소프트 리소그래피 제조를 활용하기 때문에 이 플랫폼의 구현은 간단하고 액세스 가능하며 다운스트림 분석에 적용할 수 있습니다. 이 플랫폼의 유연성, 유용성 및 감도는 다양한 범위의 세포에 대한 고유한 기계적 정보를 제공했으며 기초 과학 및 임상 진단 분야에서 더 많은 응용 분야를 지원할 수 있습니다.
단일 세포는 역동적이고 점탄성 재료입니다1. 다수의 내부 및 외부 과정 (예 : 유사 분열의 발병 또는 세포 외 기질 [ECM]의 리모델링)은 구조와 구성 2,3,4에 영향을 미치며 종종 현재 상태를 보완하는 뚜렷한 생물 물리학 적 특성을 초래합니다. 특히, 기계적 특성은 세포 발달, 생리학 및 병리학의 중요한 바이오마커로 나타났으며, 표준 분자 및 유전적 접근 5,6,7을 보완할 수 있는 귀중한 정량적 정보를 산출합니다. 예를 들어, Li 등은 최근 약물 내성 및 약물 반응성 급성 전골수성 백혈병 세포 사이의 기계적 차이를 설명하면서 RNA-seq를 사용하여 차등적으로 발현된 세포골격 관련 유전자8를 밝혀냈습니다. 단일 세포 역학과 세포 기능 간의 복잡한 상호 작용을 이해함으로써 기계 분석은 기초 과학 및 임상 진단을 변화시키는 데 더 광범위하게 적용됩니다9.
단일 세포 역학을 측정하기 위해 가장 널리 채택되는 도구는 원자력 현미경(AFM)입니다. AFM은 세포 기계적 특성의 고분해능, 국부적 인 측정을 가능하게하지만 <0.01 cells/s10의 처리량으로 제한됩니다. 대안적으로, 부유된 단일 세포(11)를 포획하고 변형시키기 위해 2개의 발산 레이저 빔을 사용하는 광학 들것은 <1 cell/s(12)의 약간 더 높은 처리량으로 제한된다. 최근 미세유체 기술의 발전으로 신속한 단일 세포 기계적 평가를 위한 차세대 장치가 가능해졌습니다12,13. 이들 기술은 좁은 수축 채널(14,15), 전단 흐름(16) 또는 유체역학적 스트레칭(17)을 사용하여 10-1,000 cells/s(18)의 처리량으로 세포를 신속하게 변형시킨다. 이러한 접근 방식의 측정 속도는 기존 기술보다 훨씬 빠르지만 제한된 기계적 판독을 위해 높은 처리량 기능을 교환하는 경우가 많습니다(보충 표 1). 앞서 언급한 모든 신속한 미세유체 방법은 세포의 탄성 특성만 반영하는 이동 시간 또는 변형성 비율과 같은 기본 단일 매개변수 메트릭에 중점을 둡니다. 그러나 단일 세포의 고유 점탄성 특성을 고려할 때 세포의 견고하고 철저한 기계적 특성화에는 탄성 성분뿐만 아니라 점성 반응도 고려해야 합니다.
Mechano-node-pore sensing (mechano-NPS) 2,8 (그림 1A)은 단일 세포 Mechanophenotyping의 기존 한계를 해결하는 미세 유체 플랫폼입니다. 이 방법을 사용하면 세포 직경, 상대 변형성 및 변형 후 회복 시간을 포함한 여러 생물물리학적 매개변수를 동시에 측정할 수 있으며 1-10 cells/s의 적당한 처리량으로 측정할 수 있습니다. 이 기술은 노드 기공 감지 (NPS) 19,20,21,22,23,24를 기반으로하며, 여기에는 4 점 프로브 측정을 사용하여 “노드”라고하는 더 넓은 영역으로 분할 된 미세 유체 채널을 통과하는 세포에 의해 생성 된 변조 전류 펄스를 측정하는 것이 포함됩니다. 변조된 전류 펄스는 셀이 세그먼트(즉, “기공”) 및 노드에서 전류의 흐름을 부분적으로 차단한 결과이며, 후자보다 전자에서 더 많은 전류가 차단됩니다. mechano-NPS에서 하나의 세그먼트 인 “수축 채널”은 셀 직경보다 좁습니다. 결과적으로 셀은 전체 채널을 통과하기 위해 변형되어야 합니다(그림 1B). 셀 직경은 셀이 수축 채널 이전에 노드 기공을 통과할 때 생성되는 서브펄스의 크기에 의해 결정될 수 있습니다(그림 1B,C). 여기서, |ΔIenp|, 즉 세포가 기공 내에 있을 때의 전류 강하는 기공에 대한 세포의 부피비, V cell/V기공 2,8,19에 비례한다. 세포 강성은 세포가 수축 채널을 통과할 때 생성되는 극적으로 더 큰 서브펄스의 지속시간인 ΔTc에 의해 결정될 수 있다(도 1B,C). 더 단단한 셀은 부드러운 셀보다 채널을 통과하는 데 더 오래 걸립니다 2,8. 마지막으로, 변형 후 원래 크기와 모양으로 돌아가는 세포의 능력인 셀 “회복”은 세포가 수축 채널 후 노드 기공을 통과할 때 생성되는 일련의 서브펄스에 의해 결정될 수 있습니다(그림 1B,C). 회복 시간 ΔTr은 셀이 압착되기 전에 현재 서브 펄스가 이전 서브 펄스의 크기로 돌아가는 데 걸리는 시간입니다. 전반적으로, 세포가 미세유체 채널을 통과할 때 생성된 변조 전류 펄스를 기록하고 분석하여 관련 단일 세포 기계적 파라미터를 추출합니다(그림 1D)2,8.
이 전자 기반 미세 유체 플랫폼의 재현성 및 사용 용이성은 이전에 입증되었습니다25. 또한 이 플랫폼은 단일 셀 기계형 분석을 위한 진입 장벽이 낮습니다. 표준 소프트 리소그래피는 미세 유체 장치를 제조하는 데 사용됩니다. 측정 하드웨어는 간단한 인쇄 회로 기판(PCB), 전원 공급 장치, 프리앰프, 데이터 수집 보드(DAQ) 및 컴퓨터를 포함한 저렴한 구성 요소로 구성됩니다. 마지막으로, 사용자 친화적인 코드를 데이터 수집 및 분석에 사용할 수 있으므로 간단하게 구현할 수 있습니다. 이 기계 형 분석 기술은 비 악성 및 악성 유방 및 폐 상피 세포주의 집단을 구별하고, 일차 인간 유방 상피 세포의 하위 계통을 구별하고, 세포 골격 섭동 및 기타 약리학 적 제제의 효과를 특성화 할 수 있습니다 2,8. 전반적으로이 플랫폼은 단일 세포의 기계 성형을위한 효과적인 접근 방식입니다.
이 기계 성형 기술을 사용하여 단일 셀의 기계적 특성을 측정하는 것은 장치 제조, 데이터 수집 및 데이터 분석의 세 단계로 구성됩니다. 각 단계에는 실험 결과에 큰 영향을 미칠 수있는 주목할만한 측면이 있습니다. 장치 제작 중에 정확하고 반복 가능한 결과를 얻으려면 일관된 채널 형상과 장치 간 균일성이 필수적입니다. 특히 각 장치의 측벽은 비교적 매끄러워야 하며(그림 4A…
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 NIBIB 1R01EB024989-01 및 NCI 1R01CA190843-01의 보조금으로 지원되었습니다. AL과 R. R.은 H2H8 협회 대학원 연구 펠로우십의 지원을 받았습니다. KLC는 National Science Foundation Graduate Research Fellowship과 Siebel Scholar Fellowship의 지원을 받았습니다.
Acetone | J.T. Baker | 5356-05 | Purity (GC) ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker) |
Aluminum Foil | n/a | n/a | |
Analog Low-Pass Filter | ThorLabs | EF504 | ≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0) |
Biopsy Punch | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | 1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25) |
Blade | n/a | n/a | |
BNC Cable | Pomona Electronics | 2249-C-12 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB |
Cleanroom Polyester Swab | Thermo Fisher Scientific | 18383 | https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383 |
Current Preamplifier | DL Instruments | 1211 | https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419 |
Custom PCB (w/ components) | n/a | n/a | see Supplemental files 4 and 5 |
DAQ Terminal Block | National Instruments | BNC-2120 | https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html |
DAQ to BNC-2110 cable | National Instruments | SHC68-68-EPM | https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html |
Data Acquisition Board (DAQ) | National Instruments | PCI-6251 | https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html |
Dessicator | Thermo Fisher Scientific | 5311-0250 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250 |
Female BNC To Banana Plug Adapter | Pomona Electronics | 72909 | https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318 |
Fetal Bovine Serum (FBS) | VWR | 89510-186 | https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs |
Glass Cutter | Chemglass | CG-1179-21 | https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips |
Gold Etchant TFA | Transene | NC0977944 | https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944 |
Hot Plate | Thermo Fisher Scientific | SP131825 | |
Isopropyl Alcohol | Spectrum Chemical | I1056-4LTPL | Purity (GC) ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056) |
Metal Hardware Enclosure | Hammond Manufacturing | EJ12126 | https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415 |
Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Purity (GC) ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561) |
MF-321 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/mf-321/ |
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist | DuPont | n/a | https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/ |
Phosphate Buffered Saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049 |
Photomask | Fineline Imaging | n/a | Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/) |
Plain Glass Microscope Slide | Fisher Scientific | 12-553-5B | Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm |
Plasma Cleaner | Harrick Plasma | PDC-001 | https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/ |
Plastic Petri Dish | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | 100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712) |
Pressure Controller | Fluigent | MFCS-EZ | https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/ |
Pressure Controller Software | Fluigent | MAESFLO | |
Programming & Computation Software | MATLAB | R2021b | for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html) |
PTFE Tubing | Cole Parmer | 06417-31 | 0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731) |
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter | Millapore Sigma | PHCC20060 | https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060 |
Silicon Wafer | Wafer World | 2885 | 76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885) |
Spin Coater | n/a | n/a | |
SU-8 3025 Negative Photoresist | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-2000/ |
SU8 Developer | Kayaku Advanced Materials | n/a | https://kayakuam.com/products/su-8-developer/ |
Sygard 184 Polydimethlysiloxane | Dow Chemical | 4019862 | https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/ |
Tape | Scotch | 810-341296 | https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB |
Titanium, Platinum, Gold | n/a | n/a | |
Triple Output Power Supply | Keysight | E36311A | https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653 |
UV Mask Aligner | Karl Suss America | MJB3 Mask Aligner |