Detección de poro de nodo mecánico: una plataforma rápida y sin etiquetas para mediciones viscoelásticas unicelulares multiparamétricas

Summary

Aquí se presenta un método para fenotipar mecánicamente células individuales utilizando una plataforma microfluídica basada en electrónica llamada detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS). Esta plataforma mantiene un rendimiento moderado de 1-10 células/s mientras mide las propiedades biofísicas elásticas y viscosas de las células.

Abstract

Las propiedades mecánicas celulares están involucradas en una amplia variedad de procesos biológicos y enfermedades, que van desde la diferenciación de células madre hasta la metástasis del cáncer. Los métodos convencionales para medir estas propiedades, como la microscopía de fuerza atómica (AFM) y la aspiración de micropipetas (MA), capturan información rica, reflejando la respuesta viscoelástica completa de una célula; Sin embargo, estos métodos están limitados por un rendimiento muy bajo. Los enfoques de alto rendimiento, como la citometría de deformabilidad en tiempo real (RT-DC), solo pueden medir información mecánica limitada, ya que a menudo están restringidos a lecturas de un solo parámetro que solo reflejan las propiedades elásticas de una célula. En contraste con estos métodos, la detección de poro mecano-nodo (mecano-NPS) es una plataforma microfluídica flexible y sin etiquetas que cierra la brecha en el logro de mediciones viscoelásticas multiparamétricas de una célula con un rendimiento moderado. Una medición de corriente continua (CC) se utiliza para monitorear las células a medida que transitan por un canal microfluídico, rastreando su tamaño y velocidad antes, durante y después de que sean forzadas a través de una constricción estrecha. Esta información (es decir, tamaño y velocidad) se utiliza para cuantificar la deformación transversal de cada célula, la resistencia a la deformación y la recuperación de la deformación. En general, esta plataforma microfluídica basada en electrónica proporciona múltiples propiedades de células viscoelásticas y, por lo tanto, una imagen más completa del estado mecánico de una célula. Debido a que requiere una preparación mínima de la muestra, utiliza una medición electrónica directa (en contraste con una cámara de alta velocidad) y aprovecha la fabricación de litografía blanda estándar, la implementación de esta plataforma es simple, accesible y adaptable al análisis posterior. La flexibilidad, utilidad y sensibilidad de esta plataforma han proporcionado información mecánica única sobre una amplia gama de células, con el potencial de muchas más aplicaciones en ciencia básica y diagnóstico clínico.

Introduction

Las células individuales son materiales dinámicos y viscoelásticos¹. Una multitud de procesos internos y externos, (por ejemplo, el inicio de la mitosis o la remodelación de la matriz extracelular [MEC]), influyen en su estructura y composición ^2,3,4, a menudo resultando en distintas propiedades biofísicas que complementan su estado actual. En particular, las propiedades mecánicas han demostrado ser biomarcadores importantes del desarrollo celular, la fisiología y la patología, produciendo información cuantitativa valiosa que puede complementar los enfoques moleculares y genéticos canónicos ^5,6,7. Por ejemplo, Li et al. describieron recientemente las diferencias mecánicas entre las células de leucemia promielocítica aguda resistentes a los medicamentos y las que responden a los medicamentos, mientras que también utilizaron RNA-seq para descubrir genes asociados al citoesqueleto expresados diferencialmente⁸. Al comprender la compleja interacción entre la mecánica unicelular y la función celular, el mecanofenotipado tiene aplicaciones más amplias en la transformación de la ciencia básica y el diagnóstico clínico⁹.

La herramienta más ampliamente adoptada para medir la mecánica unicelular es la microscopía de fuerza atómica (AFM). Si bien AFM permite una medición localizada de alta resolución de las propiedades mecánicas celulares, permanece limitado a un rendimiento de <0.01 células / s¹⁰. Alternativamente, las camillas ópticas, que utilizan dos rayos láser divergentes para atrapar y deformar celdas individuales suspendidas¹¹, están limitadas a rendimientos marginalmente más altos de <1 celda/s¹². Los avances recientes en las tecnologías microfluídicas han permitido una nueva generación de dispositivos para la evaluación mecánica rápida de una sola célula^12,13. Estas técnicas emplean canales de constricción estrechos 14,15^, flujo de cizallamiento¹⁶ o estiramiento hidrodinámico 17 para deformar las células rápidamente a rendimientos de 10-1.000 células/s ¹⁸. Si bien la tasa de medición de estos enfoques es considerablemente más rápida que las técnicas convencionales, a menudo intercambian capacidades de alto rendimiento por lecturas mecánicas limitadas (Tabla suplementaria 1). Todos los métodos microfluídicos rápidos mencionados anteriormente se centran en métricas básicas de un solo parámetro, como el tiempo de tránsito o las relaciones de deformabilidad, que solo reflejan las propiedades elásticas de una célula. Sin embargo, dada la naturaleza viscoelástica intrínseca de las células individuales, una caracterización mecánica robusta y exhaustiva de las células requiere considerar no solo los componentes elásticos sino también las respuestas viscosas.

La detección mecano-nodo-poro (mecano-NPS)^2,8 (Figura 1A) es una plataforma microfluídica que aborda las limitaciones existentes con el mecanofenotipado unicelular. Este método permite la medición de múltiples parámetros biofísicos simultáneamente, incluido el diámetro celular, la deformabilidad relativa y el tiempo de recuperación de la deformación, con un rendimiento moderado de 1-10 células / s. Esta técnica se basa en la detección nodo-poro (NPS)19,20,21,22,23,24, que consiste en utilizar una sonda de medición de cuatro puntos para medir el pulso de corriente modulada producido por una célula que transita un canal microfluídico que ha sido segmentado por regiones más amplias^, denominadas “nodos”. El pulso de corriente modulada es el resultado de que la célula bloquea parcialmente el flujo de corriente en los segmentos (es decir, “poros”) y nodos, con más corriente bloqueada en los primeros que en los segundos. En mecano-NPS, un segmento, el “canal de contracción”, es más estrecho que el diámetro de una célula; en consecuencia, una célula debe deformarse para transitar todo el canal (Figura 1B). El diámetro celular puede determinarse por la magnitud del subpulso producido cuando la célula transita por los poros del nodo antes del canal de contracción (Figuras 1B, C). Aquí, |ΔI_np|, la caída de corriente cuando la celda está en el poro, es proporcional a la relación volumen de la celda al poro, _{V célula} /_{V poro} 2,8,19. La rigidez celular puede determinarse mediante ΔT_c, la duración del subpulso dramáticamente mayor producido cuando la célula transita por el canal de contracción (Figuras 1B, C). Una célula más rígida tardará más en transitar por el canal que una más blanda ^2,8. Finalmente, la “recuperación” celular, la capacidad de la célula para volver a su tamaño y forma originales después de la deformación, puede determinarse por la serie de subpulsos producidos a medida que la célula transita por los poros del nodo después del canal de contracción (Figuras 1B, C). El tiempo de recuperación, ΔT_r, es el tiempo que tardan los subpulsos actuales en volver a la magnitud de los subpulsos anteriores, antes de que la célula sea comprimida. En general, los pulsos de corriente modulada producidos cuando una célula transita por el canal microfluídico se registran y analizan para extraer los parámetros mecánicos unicelulares relevantes (Figura 1D)^2,8.

La reproducibilidad y facilidad de uso de esta plataforma microfluídica basada en electrónica han sido demostradas previamente²⁵. Además, la plataforma presenta una baja barrera de entrada para el mecanofenotipado unicelular. La litografía blanda estándar se emplea para fabricar dispositivos microfluídicos. El hardware de medición consta de componentes económicos, que incluyen una placa de circuito impreso simple (PCB), fuente de alimentación, preamplificador, placa de adquisición de datos (DAQ) y computadora. Finalmente, el código fácil de usar está disponible para la adquisición y el análisis de datos, lo que permite una implementación sencilla. Esta técnica de mecanofenotipado puede distinguir poblaciones de líneas celulares epiteliales de mama y pulmón no malignas y malignas, discriminar entre sublinajes en células epiteliales mamarias humanas primarias y caracterizar los efectos de las perturbaciones citoesqueléticas y otros agentes farmacológicos ^2,8. En general, esta plataforma es un enfoque efectivo para el mecanofenotipado de células individuales.

Protocol

1. Diseño de la geometría del dispositivo Elija el ancho de los segmentos de tamaño y recuperación para que sea más ancho que el diámetro de las celdas más grandes a medir, pero también mantenga una relación señal-ruido (SNR) suficiente. Consulte la Tabla complementaria 2 para obtener ejemplos de diferentes anchos de segmentos de tamaño y recuperación para varias líneas celulares. Elija el ancho del segmento de contracción para aplicar una cepa del 30% a…

Representative Results

La plataforma de mecanofenotipado presentada aquí es un enfoque simple y versátil para medir las propiedades biofísicas de células individuales con un rendimiento moderado. Las células fluyen a través del canal microfluídico (Figura 1A) utilizando un flujo constante impulsado por presión. A medida que las células transitan, la longitud del canal microfluídico y los pulsos de corriente producidos se registran utilizando el hardware de adquisición de datos. La señal adquirida (<str…

Discussion

La medición de las propiedades mecánicas de células individuales utilizando esta técnica de mecanofenotipado consta de tres etapas: fabricación de dispositivos, adquisición de datos y análisis de datos. Dentro de cada etapa, hay aspectos notables que pueden afectar significativamente los resultados experimentales. Durante la fabricación del dispositivo, las geometrías de canal consistentes y la uniformidad de dispositivo a dispositivo son esenciales para obtener resultados precisos y repetibles. Específicamente…

Materials

Acetone	J.T. Baker	5356-05	Purity (GC)  ≥ 99.5% (https://us.vwr.com/store/product/6057739/acetone-99-5-vlsi-j-t-baker)
Aluminum Foil	n/a	n/a
Analog Low-Pass Filter	ThorLabs	EF504	≤240 kHz Passband, Coaxial BNC Feedthrough (https://www.thorlabs.com/thorproduct.cfm?partnumber=EF504#ad-image-0)
Biopsy Punch	Integra Miltex	33-31AA-P/25	1mm, Disposable, with Plunger (https://mms.mckesson.com/product/573313/Miltex-33-31AA-P25)
Blade	n/a	n/a
BNC Cable	Pomona Electronics	2249-C-12	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/2249-C-12/603323?utm_adgroup=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&utm_source=google&utm_ medium=cpc&utm_campaign= Shopping_Product_Cable%20Assemblies_NEW&utm_term= &utm_content=Coaxial%20Cables%20%28RF%29&gclid=Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO2sErQqnVJ pj5OXVObuTI8ZUf1ZeIn7zvzGnx mCWdePrG6SdEJMF3X6ubUaAs w-EALw_wcB
Cleanroom Polyester Swab	Thermo Fisher Scientific	18383	https://www.fishersci.com/shop/products/texwipe-cleantip-alpha-polyester-series-swabs-6/18383
Current Preamplifier	DL Instruments	1211	https://www.brltest.com/index.php?main_page=product_info&products_ id=1419
Custom PCB (w/ components)	n/a	n/a	see Supplemental files 4 and 5
DAQ Terminal Block	National Instruments	BNC-2120	https://www.ni.com/en-in/support/model.bnc-2120.html
DAQ to BNC-2110 cable	National Instruments	SHC68-68-EPM	https://www.ni.com/en-in/support/model.shc68-68-epm.html
Data Acquisition Board (DAQ)	National Instruments	PCI-6251	https://www.ni.com/docs/en-US/bundle/pci-6251-feature/page/overview.html
Dessicator	Thermo Fisher Scientific	5311-0250	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/5311-0250
Female BNC To Banana Plug Adapter	Pomona Electronics	72909	https://www.digikey.com/en/products/detail/pomona-electronics/72909/1196318
Fetal Bovine Serum (FBS)	VWR	89510-186	https://us.vwr.com/store/product/18706419/avantor-seradigm-select-grade-usda-approved-origin-fetal-bovine-serum-fbs
Glass Cutter	Chemglass	CG-1179-21	https://chemglass.com/plate-glass-cutters-diamond-tips
Gold Etchant TFA	Transene	NC0977944	https://www.fishersci.com/shop/products/NC0977944/NC0977944
Hot Plate	Thermo Fisher Scientific	SP131825
Isopropyl Alcohol	Spectrum Chemical	I1056-4LTPL	Purity (GC)  ≥99.5% (https://www.spectrumchemical.com/isopropyl-alcohol-99-percent-fcc-i1056)
Metal Hardware Enclosure	Hammond Manufacturing	EJ12126	https://www.digikey.com/en/products/detail/hammond-manufacturing/EJ12126/2423415
Methanol	Sigma-Aldrich	34860	Purity (GC)  ≥99.8% (https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/substance/methanol320467561)
MF-321 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/mf-321/
MICROPOSIT S1813 Positive Photoresist	DuPont	n/a	https://kayakuam.com/products/microposit-s1800-g2-series-photoresists/
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10010049?SID=srch-hj-10010049
Photomask	Fineline Imaging	n/a	Photomask are custom ordered from our CAD designs (https://www.fineline-imaging.com/)
Plain Glass Microscope Slide	Fisher Scientific	12-553-5B	Material: Soda Lime, L75 x W50 mm, Thickness: 0.90–1.10 mm
Plasma Cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	https://harrickplasma.com/plasma-cleaners/expanded-plasma-cleaner/
Plastic Petri Dish	Thermo Fisher Scientific	FB0875712	100 mm (https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-raised-ridge-100-x-15mm/FB0875712)
Pressure Controller	Fluigent	MFCS-EZ	https://www.fluigent.com/research/instruments/pressure-flow-controllers/mfcs-series/
Pressure Controller Software	Fluigent	MAESFLO
Programming & Computation Software	MATLAB	R2021b	for data acquisition and analysis (https://www.mathworks.com/products/matlab.html)
PTFE Tubing	Cole Parmer	06417-31	0.032" ID x 0.056" (https://www.coleparmer.com/i/masterflex-transfer-tubing-microbore-ptfe-0-032-id-x-0-056-od-100-ft-roll/0641731)
Scepter 2.0 Handheld Automatic Cell Counter	Millapore Sigma	PHCC20060	https://www.sigmaaldrich.com/IN/en/product/mm/phcc20060
Silicon Wafer	Wafer World	2885	76.2 mm, Single Side Polished (https://www.waferworld.com/product/2885)
Spin Coater	n/a	n/a
SU-8 3025 Negative Photoresist	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-2000/
SU8 Developer	Kayaku Advanced Materials	n/a	https://kayakuam.com/products/su-8-developer/
Sygard 184 Polydimethlysiloxane	Dow Chemical	4019862	https://www.ellsworth.com/products/by-market/consumer-products/encapsulants/silicone/dow-sylgard-184-silicone-encapsulant-clear-0.5-kg-kit/
Tape	Scotch	810-341296	https://www.staples.com/Scotch-Magic-Tape-810-3-4-x-36-yds-1-Core/product_130567?cid=PS:GS:SBD:PLA:OS&gclid= Cj0KCQjwlK-WBhDjARIsAO 2sErRwzrrgjU0NjFkDkne1xm vT7ekS3tdzvAgiMDwPoxocgH VTQZi7vJgaAvQZEALw_wcB
Titanium, Platinum, Gold	n/a	n/a
Triple Output Power Supply	Keysight	E36311A	https://www.newark.com/keysight-technologies/e36311a/dc-power-supply-3o-p-6v-5a-prog/dp/15AC9653
UV Mask Aligner	Karl Suss America	MJB3 Mask Aligner