منصة رقاقة الموائع الدقيقة السريرية لعزل الخلايا السرطانية المنتشرة متعددة الاستخدامات
Summary
رقاقة الموائع الدقيقة السريرية هي تقنية تحليل طبي حيوي مهمة تبسط المعالجة المسبقة لعينات دم المريض السريرية وتلطخ الخلايا السرطانية المنتشرة في الموقع على الرقاقة ، مما يسمح بالكشف السريع وتحديد CTC واحد.
Abstract
تعتبر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) مهمة في تشخيص السرطان والتشخيص والعلاج المضاد للسرطان. يعد تعداد CTC أمرا حيويا في تحديد مرض المريض لأن CTCs نادرة وغير متجانسة. يتم فصل CTCs عن الورم الرئيسي ، وتدخل نظام الدورة الدموية ، ويحتمل أن تنمو في مواقع بعيدة ، وبالتالي تنتشر الورم. نظرا لأن CTCs تحمل معلومات مماثلة للورم الرئيسي ، فإن عزل CTC والتوصيف اللاحق يمكن أن يكون حاسما في مراقبة السرطان وتشخيصه. يعد التعداد وتعديل التقارب وتلطيخ التألق المناعي السريري ل CTCs النادرة طرقا قوية لعزل CTC لأنها توفر العناصر الضرورية ذات الحساسية العالية. تقدم رقائق الموائع الدقيقة طريقة خزعة سائلة خالية من أي ألم للمرضى. في هذا العمل ، نقدم قائمة بالبروتوكولات الخاصة برقائق الموائع الدقيقة السريرية ، وهي منصة عزل CTC متعددة الاستخدامات ، والتي تتضمن مجموعة من الوظائف والخدمات المطلوبة لفصل CTC وتحليلها وتشخيصها المبكر ، وبالتالي تسهيل التحليل الجزيئي الحيوي وعلاج السرطان. يتضمن البرنامج عد الخلايا السرطانية النادرة ، والمعالجة المسبقة لدم المريض السريري ، والتي تشمل تحلل خلايا الدم الحمراء ، وعزل والتعرف على CTCs في الموقع على رقائق الموائع الدقيقة. يسمح البرنامج بالتعداد الدقيق للخلايا السرطانية أو CTCs. بالإضافة إلى ذلك ، يتضمن البرنامج أداة تتضمن عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة متعددة الاستخدامات وتحديد التألق المناعي في الموقع على الرقائق ، يليه التحليل الجزيئي الحيوي.
Introduction
تعتبر الخلايا السرطانية المنتشرة (CTCs) مهمة في تشخيص السرطان والتشخيص والعلاج المضاد للسرطان. يعد تعداد CTC أمرا حيويا لأن CTCs نادرة وغير متجانسة. يعد التعداد وتعديل التقارب وتلطيخ التألق المناعي السريري ل CTCs النادرة تقنيات قوية لعزل CTC لأنها توفر العناصر الضرورية ذات الحساسية العالية1. عدد نادر من الخلايا السرطانية الممزوجة بالدم الطبيعي تحاكي عن كثب دم المريض الحقيقي لأن 2-3 مل من دم المريض الحقيقي يحتوي فقط على 1-10 CTCs. لحل مشكلة تجريبية حرجة ، بدلا من استخدام عدد كبير من الخلايا السرطانية التي تم إدخالها في برنامج تلفزيوني أو مختلطة بالدم الطبيعي ، فإن استخدام عدد نادر من الخلايا السرطانية يوفر لنا عددا منخفضا من خلايا الدم ، وهو أقرب إلى الواقع عند إجراء تجربة.
السرطان هو السبب الرئيسي للوفاة في العالم2. CTCs هي خلايا سرطانية يتم التخلص منها من الورم الأصلي الذي يدور في الدم وأنظمة الدورة اللمفاوية3. عندما تنتقل CTCs إلى بيئة جديدة قابلة للبقاء ، فإنها تنمو كورم ثان. وهذا ما يسمى ورم خبيث وهو مسؤول عن 90 ٪ من الوفيات في مرضى السرطان4. CTCs حيوية للتشخيص والتشخيص المبكر وفهم آليات السرطان. ومع ذلك ، فإن CTCs نادرة للغاية وغير متجانسة في دم المريض 5,6.
تقدم رقائق الموائع الدقيقة خزعة سائلة لا تغزو الورم. لديهم ميزة كونها محمولة ومنخفضة التكلفة ولديها مقياس مطابق للخلايا. يصنف عزل CTCs مع رقائق الموائع الدقيقة بشكل أساسي إلى نوعين: قائم على التقارب ، والذي يعتمد على ارتباط الأجسام المضادةللمستضد 7،8،9 وهو الطريقة الأصلية والأكثر استخداما لعزل CTC. والرقائق الفيزيائية ، التي تستخدم اختلافات الحجم والتشوه بين الخلايا السرطانية وخلايا الدم 10،11،12،13،14،15 ، خالية من الملصقات وسهلة التشغيل. تتمثل ميزة رقائق الموائع الدقيقة على التقنيات البديلة في أن النهج القائم على المادية للمرشحات الدقيقة ذات القطع الناقص الكبير يلتقط بقوة CTCs بكفاءة التقاط عالية. والسبب في ذلك هو أن الأعمدة الدقيقة البيضاوي يتم تنظيمها في أنفاق رفيعة من فجوات خط الخط. تختلف فجوات الخط الخطي عن الفجوات التقليدية بين النقاط والنقاط التي تشكلها الأعمدة الدقيقة مثل المعين الصغير. يجمع التقاط CTCs القائم على الشريحة الموجية بين العزلة القائمة على الخصائص المادية والقائمة على التقارب. يتضمن الالتقاط القائم على الشريحة الموجية 30 صفيفا على شكل موجة مع الجسم المضاد ل EpCAM المطلي على أعمدة دقيقة دائرية. يتم التقاط CTCs بواسطة الفجوات الصغيرة ، ويتم استخدام الفجوات الكبيرة لتسريع معدل التدفق. يجب أن تجتاز CTCs المفقودة الفجوات الصغيرة في المصفوفة التالية ويتم التقاطها من خلال العزلة القائمة على التقارب المدمجة داخل الشريحة16.
الهدف من البروتوكول هو إظهار عد أعداد نادرة من الخلايا السرطانية والتحليل السريري ل CTCs مع رقائق الموائع الدقيقة. يصف البروتوكول خطوات عزل CTC ، وكيفية الحصول على عدد منخفض من الخلايا السرطانية ، والفصل المادي السريري لمرشحات القطع الناقص الصغيرة ، ومرشحات القطع الناقص الكبير ، ومرشحات شبه المنحرف ، وتعديل التقارب ، والتخصيب17.
Protocol
Representative Results
Discussion
التشخيص والتشخيص المبكر للسرطان لهما تأثير كبير على علاج السرطان1. يوفر عزل CTC مع رقائق الموائع الدقيقة خزعة سائلة بدون غزو. ومع ذلك ، فإن CTCs نادرة للغاية وغير متجانسة في الدم1 ، مما يجعل من الصعب عزل CTCs. CTCs لها خصائص مماثلة لمصادر الورم الأصلية التي نشأت منها. وبالت…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل البحثي من قبل مؤسسة آنهوي للعلوم الطبيعية في الصين (1908085MF197 ، 1908085QB66) ، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (21904003) ، ومشروع البحث العلمي للجنة تيانجين التعليمية (2018KJ154) ، وبرنامج أبحاث العلوم الطبيعية الإقليمي لمؤسسات التعليم العالي في مقاطعة آنهوي (KJ2020A0239) ، ومختبر شنغهاي الرئيسي لمعالجة المعلومات متعددة الأبعاد ، مختبر شرق الصين الرئيسي للمعلومات متعددة الأبعاد المعالجة ، جامعة شرق الصين للمعلمين (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Referenzen
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
