Plataforma de chip microfluídico clínico para o isolamento de células tumorais circulantes versáteis
Summary
O chip microfluídico clínico é uma importante técnica de análise biomédica que simplifica o pré-processamento de amostras de sangue de pacientes clínicos e cora por imunofluorescência as células tumorais circulantes (CTCs) in situ no chip, permitindo a rápida detecção e identificação de uma única CTC.
Abstract
As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital na determinação da doença do paciente, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. As CTCs são descoladas do tumor primário, entram no sistema de circulação sanguínea e potencialmente crescem em locais distantes, metastatizando o tumor. Como as CTCs carregam informações semelhantes às do tumor primário, o isolamento da CTC e sua posterior caracterização podem ser fundamentais no monitoramento e diagnóstico do câncer. A enumeração, modificação de afinidade e coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são métodos poderosos para o isolamento de CTC, pois fornecem os elementos necessários com alta sensibilidade. Os chips microfluídicos oferecem um método de biópsia líquida que é livre de qualquer dor para os pacientes. Neste trabalho, apresentamos uma lista de protocolos para chips microfluídicos clínicos, uma versátil plataforma de isolamento CTC, que incorpora um conjunto de funcionalidades e serviços necessários para a separação, análise e diagnóstico precoce da CTC, facilitando assim a análise biomolecular e o tratamento do câncer. O programa inclui contagem de células tumorais raras, pré-processamento clínico de sangue de pacientes, que inclui lise de hemácias, e o isolamento e reconhecimento de CTCs in situ em chips microfluídicos. O programa permite a enumeração precisa de células tumorais ou CTCs. Além disso, o programa inclui uma ferramenta que incorpora isolamento CTC com chips microfluídicos versáteis e identificação de imunofluorescência in situ nos chips, seguida de análise biomolecular.
Introduction
As células tumorais circulantes (CTCs) são significativas no prognóstico, diagnóstico e terapia anticâncer do câncer. A enumeração da CTC é vital, uma vez que as CTCs são raras e heterogêneas. A enumeração, a modificação da afinidade e a coloração clínica por imunofluorescência de CTCs raras são técnicas poderosas para o isolamento de CTC, pois oferecem os elementos necessários com altasensibilidade1. O número raro de células tumorais misturadas com sangue normal imita de perto o sangue real do paciente, uma vez que 2-3 mL de sangue real do paciente contém apenas 1-10 CTCs. Para resolver um problema experimental crítico, em vez de usar um grande número de células tumorais introduzidas em PBS ou misturadas com sangue normal, o uso de um número raro de células tumorais nos fornece um número baixo de células sanguíneas, o que é mais próximo da realidade ao realizar um experimento.
O câncer é a principal causa de morte no mundo2. As CTCs são células tumorais eliminadas do tumor original que circulam nos sistemas de circulação sanguínea e linfática3. Quando os CTCs se movem para um novo ambiente de sobrevivência, eles crescem como um segundo tumor. Isso é chamado de metástase e é responsável por 90% das mortes em pacientes comcâncer4. As CTCs são vitais para o prognóstico, diagnóstico precoce e para a compreensão dos mecanismos do câncer. Entretanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue dos pacientes 5,6.
Os chips microfluídicos oferecem uma biópsia líquida que não invade o tumor. Eles têm a vantagem de serem portáteis, de baixo custo e terem uma escala compatível com células. O isolamento de CTCs com chips microfluídicos é classificado principalmente em dois tipos: baseado em afinidade, que se baseia na ligação antígeno-anticorpo7,8,9 e é o método original e mais amplamente utilizado de isolamento de CTC; e chips de base física, que utilizam diferenças de tamanho e deformabilidade entre células tumorais e células sanguíneas 10,11,12,13,14,15, são livres de marcação e de fácil operação. A vantagem dos chips microfluídicos sobre as técnicas alternativas é que a abordagem física dos microfiltros de grande elipse captura firmemente os CTCs com alta eficiência de captura. A razão para isso é que os micropostes de elipse são organizados em túneis finos de lacunas de linha de linha. Os gaps de linha são diferentes dos tradicionais gaps ponto-ponto formados por micropostes, como micropostes losangos. A captura de CTCs baseada em chip de onda combina isolamento baseado em propriedades físicas e em afinidade. A captura baseada em chip de onda envolve 30 matrizes em forma de onda com o anticorpo de anti-EpCAM revestido em micropostes circulares. Os CTCs são capturados pelas pequenas folgas, e as grandes lacunas são usadas para acelerar a vazão. Os CTCs perdidos precisam passar pelas pequenas lacunas no próximo array e são capturados pelo isolamento baseado em afinidade integrado dentro do chip16.
O objetivo do protocolo é demonstrar a contagem de números raros de células tumorais e a análise clínica de CTCs com chips microfluídicos. O protocolo descreve as etapas de isolamento da CTC, como obter um baixo número de células tumorais, a separação física clínica de filtros de elipse pequena, filtros de elipse grande e filtros de trapézio, modificação de afinidade e enriquecimento17.
Protocol
Representative Results
Discussion
O prognóstico e o diagnóstico precoce do câncer têm efeito significativo no tratamento do câncer1. O isolamento do CTC com chips microfluídicos oferece uma biópsia líquida sem invasão. No entanto, as CTCs são extremamente raras e heterogêneas no sangue1, o que torna difícil isolar as CTCs. As CTCs têm propriedades semelhantes às fontes tumorais originais das quais se originam. Assim, as CTCs desempenham um papel vital na metástase docâncer1…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho de pesquisa foi apoiado pela Fundação de Ciências Naturais de Anhui da China (1908085MF197, 1908085QB66), a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (21904003), o Projeto de Pesquisa Científica da Comissão de Educação de Tianjin (2018KJ154), o Programa Provincial de Pesquisa em Ciências Naturais de Instituições de Ensino Superior da Província de Anhui (KJ2020A0239) e o Laboratório Chave de Xangai de Processamento de Informações Multidimensionais, Laboratório Chave de Informações Multidimensionais da China Oriental Processamento, Universidade Normal da China Oriental (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Referenzen
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
