Essai de sédimentation basé sur la concanavaline A pour mesurer la liaison au substrat des phosphatases glucanes
Summary
Cette méthode décrit un essai de sédimentation in vitro à base de lectine pour quantifier l’affinité de liaison de la phosphatase glucane et de l’amylopectine. Ce test de co-sédimentation est fiable pour mesurer la liaison du substrat de la phosphatase glucane et peut être appliqué à divers substrats de glucane solubilisés.
Abstract
Les phosphatases glucanes appartiennent à la grande famille des phosphatases à double spécificité (DSP) qui déphosphorylent les substrats de glucanes, tels que le glycogène chez les animaux et l’amidon chez les plantes. Les structures cristallines de la phosphatase glucane avec des substrats de glucane modèles révèlent des interfaces distinctes de liaison au glucane constituées de domaines DSP et de liaison aux glucides. Cependant, les mesures quantitatives des interactions de la phosphatase glucane-glucane avec des substrats physiologiquement pertinents sont fondamentales pour la compréhension biologique de la famille des enzymes phosphatases glucane et la régulation du métabolisme énergétique. Ce manuscrit rapporte un essai de sédimentation in vitro basé sur la concanavaline A (ConA) conçu pour détecter l’affinité de liaison au substrat des phosphatases glucanes contre différents substrats de glucanes. Comme preuve de concept, la constante de dissociation (KD) de la phosphatase glucane Arabidopsis thaliana Starch Excess4 (SEX4) et de l’amylopectine a été déterminée. La caractérisation des mutants SEX4 et d’autres membres de la famille des enzymes phosphatases glucane démontre une fois de plus l’utilité de ce test pour évaluer la liaison différentielle des interactions protéine-glucides. Ces données démontrent la pertinence de ce test pour caractériser une large gamme de protéines interagissant avec l’amidon et le glycogène.
Introduction
Les phosphatases glucanes sont membres d’une sous-famille fonctionnellement diversifiée de phosphatases à double spécificité (DSP) au sein de la superfamille1 de la protéine tyrosine phosphatase (PTP). Ils ont été trouvés dans la plupart des formes de vie, y compris les organismes photosynthétiques très divergents, les humains, les vertébrés et certains invertébrés et protistes 2,3,4. Les plantes contiennent trois phosphatases glucanes connues : Starch Excess4 (SEX4), Like Sex Four1 (LSF1) et Like Sex Four2 (LSF2)5,6,7. Les plantes dépourvues de phosphatases glucanes présentent une diminution des taux de dégradation transitoire de l’amidon et d’accumulation d’amidon dans les feuilles 8,9. La laforine est le membre fondateur de la famille des phosphatases glucanes qui déphosphoryle le glycogène chez les vertébrés et les humains 3,10. Les mutations de la laforine entraînent la maladie neurodégénérative de Lafora, une forme autosomique récessive mortelle de l’épilepsie11. Les phosphatases glucanes sont nécessaires au métabolisme du glycogène et de l’amidon et sont apparues comme des enzymes importantes pour moduler la teneur en amidon des plantes et traiter la maladie neurodégénérative de Lafora12,13. Des études récentes de cristallographie aux rayons X sur des phosphatases de glucane avec des substrats de glucane modèles ont mis en lumière la liaison du substrat et le mécanisme catalytique de la déphosphorylation du glucane14,15,16,17. Cependant, la compréhension actuelle de la façon dont les phosphatases glucanes se lient à leurs substrats physiologiques est incomplète.
L’amidon est un polymère insoluble de glucose composé de 80% à 90% d’amylopectine et de 10% à 20% d’amylose18. Les substrats des phosphatases de glucane végétaux sont des molécules de glucides phosphorylés, telles que le glycogène et les granules d’amidon. Les résidus de glucosyle phosphorylés sont présents à un rapport phosphate:glucosyl de 1:600. Fait intéressant, les phosphates ne sont présents que sur les molécules d’amylopectine19. La plante principale glucane phosphatase SEX4 agit sur le granule d’amidon pour déphosphoryler les molécules d’amylopectine. La structure cristalline en rayons X de SEX4 combinée à des études de mutagénèse guidée par la structure a démontré les spécificités uniques du substrat de SEX4 pour différentes positions au sein d’une structure de glucane15. Nous avons récemment montré que l’activité biologiquement pertinente de SEX4 ne peut être observée que lorsqu’elle agit sur ses substrats d’amylopectine solubilisés20. Cependant, la compréhension des interactions glucane-SEX4 s’est avérée difficile en raison de la complexité structurelle du substrat, des spécificités de liaison plus larges et des faibles affinités de liaison entre la protéine et ses substrats. Ces problèmes ont entravé la capacité d’utiliser des méthodes couramment utilisées dans les interactions protéine-ligand, telles que la calorimétrie de titrage isotherme (ITC), la spectroscopie par résonance magnétique nucléaire (RMN) et les tests basés sur des tests immuno-enzymatiques (ELISA).
Fait intéressant, une grande partie de notre compréhension des interactions glucides-protéines provient de l’étude des lectines. La concanavaline A (ConA) est une famille de lectines de légumineuses extraites à l’origine du haricot jacquier. ConA lie les glucides avec une spécificité élevée, ce qui est avantageux pour son utilisation dans les applications de ciblage et d’administration de médicaments. La liaison de ConA à une variété de substrats contenant du α-D-mannosyl non réducteur et du α-D-glucosyl a été largement étudiée19,20. Les billes de sépharose liées à ConA disponibles dans le commerce sont couramment utilisées pour purifier les glycoprotéines et les glycolipides21. ConA se lie à ces glucanes via les groupes hydroxyles C3, C4 et C6 des résidus de glucose. Les billes ConA-Sepharose ont également été utilisées avec succès pour mesurer la liaison des interactions glycogène-protéine et amidon-protéine22,23. Dans cette étude, nous avons utilisé des billes ConA-Sepharose pour développer un test de liaison afin de mesurer les spécificités de liaison des interactions phosphatase-amylopectine glucane.
Auparavant, un test de sédimentation basé sur ConA a été utilisé pour évaluer la capacité de liaison du substrat de la phosphataseglucane 14,20,24. Dans cette étude, la même stratégie a été utilisée pour développer une nouvelle méthode permettant de déterminer l’affinité de liaison de la phosphatase glucane-glucane et des interactions glucidiques. Cette méthode présente également un avantage pour étudier diverses interactions glucides-protéines solubilisées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cette étude démontre le développement réussi d’un nouveau test de sédimentation in vitro qui permet de déterminer l’affinité de liaison des interactions glucane-glucane phosphatase. La conception du dosage tire parti de la liaison spécifique de la lectine ConA aux glucanes via les résidus hydroxyles du glucose pour capturer indirectement les substrats glucidiques solubilisés sur les billes de sépharose. Cela permet la séparation des fractions protéiques liées et non liées par…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été soutenue par le prix MCB-2012074 de la National Science Foundation. Les auteurs remercient le Dr Craig W. Vander Kooi du Département de biochimie et de biologie moléculaire de l’Université de Floride pour ses précieuses discussions et son soutien. Les auteurs remercient également le Dr Matthew S. Gentry du Département de biochimie et de biologie moléculaire de l’Université de Floride pour son soutien. Nous tenons à remercier la Dre Sara Lagalwar, présidente du programme de neurosciences du Collège Skidmore, de nous avoir permis d’utiliser le scanner par transfert C LICOR pour l’imagerie par transfert Western.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
Referenzen
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