Ensayo de sedimentación basado en concanavalina A para medir la unión al sustrato de las fosfatasas de glucano
Summary
Este método describe un ensayo de sedimentación in vitro basado en lectinas para cuantificar la afinidad de unión de la glucano fosfatasa y la amilopectina. Este ensayo de cosedimentación es confiable para medir la unión del sustrato de glucano fosfatasa y se puede aplicar a varios sustratos de glucano solubilizados.
Abstract
Las fosfatasas de glucano pertenecen a la familia más grande de fosfatasas de especificidad dual (DSP) que desfosforilan sustratos de glucano, como el glucógeno en animales y el almidón en plantas. Las estructuras cristalinas de la glucano fosfatasa con sustratos de glucano modelo revelan distintas interfaces de unión a glucanos hechas de DSP y dominios de unión a carbohidratos. Sin embargo, las mediciones cuantitativas de las interacciones glucano-glucano fosfatasa con sustratos fisiológicamente relevantes son fundamentales para la comprensión biológica de la familia de enzimas glucano fosfatasa y la regulación del metabolismo energético. Este manuscrito informa de un ensayo de sedimentación in vitro basado en Concanavalina A (ConA) diseñado para detectar la afinidad de unión al sustrato de las fosfatasas de glucano contra diferentes sustratos de glucano. Como prueba de concepto, se determinó la constante de disociación (KD) de la glucano fosfatasa Arabidopsis thaliana Almidón Exceso4 (SEX4) y amilopectina. La caracterización de los mutantes SEX4 y otros miembros de la familia de enzimas glucano fosfatasa demuestra aún más la utilidad de este ensayo para evaluar la unión diferencial de las interacciones proteína-carbohidrato. Estos datos demuestran la idoneidad de este ensayo para caracterizar una amplia gama de proteínas que interactúan con el almidón y el glucógeno.
Introduction
Las fosfatasas de glucano son miembros de una subfamilia funcionalmente diversa de fosfatasas de especificidad dual (DSP) dentro de la superfamilia1 de la proteína tirosina fosfatasa (PTP). Se han encontrado en la mayoría de las formas de vida, incluyendo organismos fotosintéticos ampliamente divergentes, humanos, vertebrados y algunos invertebrados y protistas 2,3,4. Las plantas contienen tres fosfatasas de glucano conocidas: Almidón Exceso4 (SEX4), Como Sexo Cuatro1 (LSF1) y Como Sexo Cuatro2 (LSF2)5,6,7. Las plantas que carecen de glucano fosfatasas muestran tasas disminuidas de degradación transitoria del almidón y acumulación de almidón en las hojas 8,9. Laforin es el miembro fundador de la familia glucano fosfatasa que desfosforila glucógeno en vertebrados y humanos 3,10. Las mutaciones de laforina resultan en la enfermedad neurodegenerativa de Lafora, una forma autosómica recesiva fatal de epilepsia11. Las glucano fosfatasas son necesarias para el metabolismo del glucógeno y del almidón y han surgido como enzimas importantes para modular el contenido de almidón en las plantas y tratar la enfermedad neurodegenerativa de Lafora12,13. Estudios recientes de cristalografía de rayos X sobre fosfatasas de glucano con sustratos de glucano modelo han arrojado luz sobre la unión al sustrato y el mecanismo catalítico de la desfosforilación de glucanos14,15,16,17. Sin embargo, la comprensión actual de cómo las fosfatasas de glucano se unen a sus sustratos fisiológicos es incompleta.
El almidón es un polímero insoluble de glucosa hecho de 80% -90% de amilopectina y 10% -20% de amilosa18. Los sustratos para las fosfatasas de glucano vegetal son moléculas de carbohidratos fosforilados, como el glucógeno y los gránulos de almidón. Los residuos de glucosilo fosforilados están presentes en una proporción de 1:600 fosfato:residuo de glucosil. Curiosamente, los fosfatos están presentes sólo en las moléculas de amilopectina19. La principal glucano fosfatasa de la planta SEX4 actúa sobre el gránulo de almidón para desfosforilar las moléculas de amilopectina. La estructura cristalina de rayos X de SEX4 combinada con estudios de mutagénesis guiada por estructura ha demostrado las especificidades únicas del sustrato de SEX4 para diferentes posiciones dentro de una estructura de glucano15. Recientemente hemos demostrado que la actividad biológicamente relevante de SEX4 sólo puede observarse cuando actúa sobre sus sustratos de amilopectina solubilizados20. Sin embargo, comprender las interacciones glucano-SEX4 ha demostrado ser difícil debido a la complejidad estructural del sustrato, las especificidades de unión más amplias y las bajas afinidades de unión entre la proteína y sus sustratos. Estos problemas han obstaculizado la capacidad de utilizar métodos comúnmente utilizados en las interacciones proteína-ligando, como la calorimetría de titulación isotérmica (ITC), la espectroscopia de resonancia magnética nuclear (RMN) y los ensayos basados en ensayos de inmunoadsorción ligados a enzimas (ELISA).
Curiosamente, gran parte de nuestra comprensión de las interacciones carbohidratos-proteínas proviene del estudio de las lectinas. La concanavalina A (ConA) es una familia de proteínas lectinas de leguminosas originalmente extraídas del frijol jack. ConA se une a los carbohidratos con alta especificidad, lo que es ventajoso para su uso en aplicaciones de administración y orientación de fármacos. La unión de ConA a una variedad de sustratos que contienen α-D-manosil y α-D-glucosilo no reductores ha sido ampliamente estudiada19,20. Las perlas de sefarosa unidas a ConA disponibles comercialmente se usan comúnmente para purificar glicoproteínas y glicolípidos21. ConA se une a estos glucanos a través de los grupos hidroxilo C3, C4 y C6 de los residuos de glucosa. Las perlas de ConA-Sepharose también se han utilizado con éxito para medir la unión de las interacciones glucógeno-proteína y almidón-proteína22,23. En este estudio, utilizamos perlas de ConA-Sepharose para desarrollar un ensayo de unión para medir las especificidades de unión de las interacciones glucano fosfatasa-amilopectina.
Anteriormente, se empleó un ensayo de sedimentación basado en ConA para evaluar la capacidad de unión al sustrato de glucano fosfatasa14,20,24. En este estudio, se utilizó la misma estrategia para desarrollar un método novedoso para determinar la afinidad de unión de las interacciones glucano-glucano fosfatasa y carbohidratos. Este método también tiene una ventaja para investigar varias interacciones carbohidratos-proteínas solubilizadas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio demuestra el desarrollo exitoso de un nuevo ensayo de sedimentación in vitro que permite determinar la afinidad de unión de las interacciones glucano-glucano fosfatasa. El diseño del ensayo aprovecha la unión específica de la lectina ConA a los glucanos a través de los residuos hidroxilo de glucosa para capturar indirectamente sustratos de carbohidratos solubilizados en perlas de Sepharose. Esto permite la separación de fracciones de proteínas unidas y no unidas mediante ce…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por el premio MCB-2012074 de la National Science Foundation. Los autores agradecen al Dr. Craig W. Vander Kooi del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Florida por sus valiosas discusiones y apoyo. Los autores también agradecen al Dr. Matthew S. Gentry del Departamento de Bioquímica y Biología Molecular de la Universidad de Florida por su apoyo. Sara Lagalwar, presidenta del programa de Neurociencia de Skidmore College, por permitirnos usar el escáner de borrones de dígitos C LICOR para imágenes de Western Blot.
Materials
| 6x-His Tag monoclonal antibody (HIS.H8), HRP | Therm Fisher Scientific | MA1-21315-HRP | |
| Biorad gel electrophoresis and Western blot kit | Biorad | 1703930 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 208291 | |
| C-Digit blot scanner | LICOR | 3600-00 | Blot scanner |
| Complete protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | 11836170001 | |
| Concanavalin A-sepharose beads | Sigma-Aldrich | C9017 | This product contains in 0.1 M acetate buffer, pH 6, containing 1 M NaCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MnCl2, and 1 mM MgCl2 in 20% ethanol |
| Centrifuge | Eppendorf | 5425R | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-5 | |
| GraphPad Prism 8.0 software | GraphPad | Version 8.0 | Data analysis software |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H8651 | |
| Image Studio | LICOR | 3600-501 | Acquisition Software |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| Methanol | Fisher Scientific | A452SK-4 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Fisher Scientific | PI28312 | |
| Potato amylopectin | Sigma-Aldrich | A8515 | |
| Precast SDSPAGE Gels | Genscript | M00653S | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP154-1 | |
| Tween 20 | Fisher Scientific | MP1TWEEN201 | |
| Westernsure premium chemiluminescence substrate | LI-COR | 926-95000 |
Referenzen
- Meekins, D. A., Vander Kooi, C. W., Gentry, M. S. Structural mechanisms of plant glucan phosphatases in starch metabolism. The FEBS Journal. 283 (13), 2427-2447 (2016).
- Gentry, M. S., et al. The phosphatase laforin crosses evolutionary boundaries and links carbohydrate metabolism to neuronal disease. The Journal of Cell Biology. 178 (3), 477-488 (2007).
- Worby, C. A., Gentry, M. S., Dixon, J. E. Laforin, a dual specificity phosphatase that dephosphorylates complex carbohydrates. The Journal of Biological Chemistry. 281 (41), 30412-30418 (2006).
- Gentry, M. S., Pace, R. M. Conservation of the glucan phosphatase laforin is linked to rates of molecular evolution and the glucan metabolism of the organism. BMC Evolutionary Biology. 9, 138 (2009).
- Niittyla, T., et al. Similar protein phosphatases control starch metabolism in plants and glycogen metabolism in mammals. The Journal of Biological Chemistry. 281 (17), 11815-11818 (2006).
- Kotting, O., et al. STARCH-EXCESS4 is a laforin-like Phosphoglucan phosphatase required for starch degradation in Arabidopsis thaliana. The Plant Cell. 21 (1), 334-346 (2009).
- Comparot-Moss, S., et al. A putative phosphatase, LSF1, is required for normal starch turnover in Arabidopsis leaves. Plant Physiology. 152 (2), 685-697 (2010).
- Zeeman, S. C., Northrop, F., Smith, A. M., Rees, T. A starch-accumulating mutant of Arabidopsis thaliana deficient in a chloroplastic starch-hydrolysing enzyme. The Plant Journal: For Cell and Molecular Biology. 15 (3), 357-365 (1998).
- Kotting, O., et al. Identification of a novel enzyme required for starch metabolism in Arabidopsis leaves. The phosphoglucan, water dikinase. Plant Physiology. 137 (1), 242-252 (2005).
- Tagliabracci, V. S., et al. Laforin is a glycogen phosphatase, deficiency of which leads to elevated phosphorylation of glycogen in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (49), 19262-19266 (2007).
- Gentry, M. S., Guinovart, J. J., Minassian, B. A., Roach, P. J., Serratosa, J. M. Lafora disease offers a unique window into neuronal glycogen metabolism. The Journal of Biological Chemistry. 293 (19), 7117-7125 (2018).
- Brewer, M. K., et al. Targeting pathogenic lafora bodies in lafora disease using an antibody-enzyme fusion. Cell Metabolism. 30 (4), 689-705 (2019).
- Santelia, D., Zeeman, S. C. Progress in Arabidopsis starch research and potential biotechnological applications. Current Opinion in Biotechnology. 22 (2), 271-280 (2011).
- Raththagala, M., et al. Structural mechanism of laforin function in glycogen dephosphorylation and lafora disease. Molecular Cell. 57 (2), 261-272 (2015).
- Meekins, D. A., et al. Phosphoglucan-bound structure of starch phosphatase Starch Excess4 reveals the mechanism for C6 specificity. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (20), 7272-7277 (2014).
- Vander Kooi, C. W., et al. Structural basis for the glucan phosphatase activity of Starch Excess4. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (35), 15379-15384 (2010).
- Meekins, D. A., et al. Structure of the Arabidopsis glucan phosphatase like sex four2 reveals a unique mechanism for starch dephosphorylation. The Plant Cell. 25 (6), 2302-2314 (2013).
- Smith, A. M., Zeeman, S. C. Starch: A flexible, adaptable carbon store coupled to plant growth. Annual Review of Plant Biology. 71, 217-245 (2020).
- Jane, J., Kasemuwan, T., Chen, J. F., Juliano, B. O. Phosphorus in rice and other starches. Cereal Foods World. 41 (11), 827-832 (1996).
- Mak, C. A., et al. Cooperative kinetics of the glucan phosphatase starch excess4. Biochemie. 60 (31), 2425-2435 (2021).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H. Purification and characterization of the 53,000-dalton glycoprotein from the sarcoplasmic reticulum. The Journal of Biological Chemistry. 256 (9), 4626-4632 (1981).
- Campbell, K. P., MacLennan, D. H., Jorgensen, A. O., Mintzer, M. C. Purification and characterization of calsequestrin from canine cardiac sarcoplasmic reticulum and identification of the 53,000 dalton glycoprotein. The Journal of Biological Chemistry. 258 (2), 1197-1204 (1983).
- Davey, M. W., Sulkowski, E., Carter, W. A. Binding of human fibroblast interferon to concanavalin A-agarose. Involvement of carbohydrate recognition and hydrophobic interaction. Biochemie. 15 (3), 704-713 (1976).
- Meekins, D. A., et al. Mechanistic insights into glucan phosphatase activity against polyglucan substrates. The Journal of Biological Chemistry. 290 (38), 23361-23370 (2015).
- Wilkens, C., et al. Plant α-glucan phosphatases SEX4 and LSF2 display different affinity for amylopectin and amylose. FEBS Letters. 590 (1), 118-128 (2016).
- Atanasova, M., Bagdonas, H., Agirre, J. Structural glycobiology in the age of electron cryo-microscopy. Current Opinion in Structural Biology. 62, 70-78 (2020).
- Doyle, M. L. Characterization of binding interactions by isothermal titration calorimetry. Current Opinion in Biotechnology. 8 (1), 31-35 (1997).
