Trasplante intraperitoneal para la generación de leucemia mieloide aguda en ratones
Summary
Aquí, la inyección intraperitoneal de células leucémicas se utiliza para establecer y propagar la leucemia mieloide aguda (LMA) en ratones. Este nuevo método es eficaz en el trasplante seriado de células de LMA y puede servir como una alternativa para aquellos que pueden experimentar dificultades e inconsistencias con la inyección intravenosa en ratones.
Abstract
Existe una necesidad insatisfecha de nuevas terapias para tratar la leucemia mieloide aguda (LMA) y la recaída asociada que involucra células madre de leucemia persistente (LSC). Un modelo experimental de roedores AML para probar terapias basadas en el trasplante exitoso de estas células a través de inyecciones retroorbitarias en ratones receptores está lleno de desafíos. El objetivo de este estudio fue desarrollar un método fácil, confiable y consistente para generar un modelo murino robusto de LMA utilizando una ruta intraperitoneal. En el presente protocolo, las células de la médula ósea se transdujeron con un retrovirus que expresa la oncoproteína de fusión MLL-AF9 humana. Se probó la eficiencia de las poblaciones de linaje negativo (Lin-) y Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como LSC de donantes en el desarrollo de LMA primaria, y se adoptó la inyección intraperitoneal como un nuevo método para generar LMA. La comparación entre las inyecciones intraperitoneales y retroorbitarias se realizó en trasplantes seriados para comparar y contrastar los dos métodos. Tanto las células Lin como las LSK transducidas con el virus MLL-AF9 humano se injertaron bien en la médula ósea y el bazo de los receptores, lo que llevó a una LMA en toda regla. La inyección intraperitoneal de células del donante estableció la LMA en los receptores tras el trasplante seriado, y la infiltración de células de LMA se detectó en la sangre, la médula ósea, el bazo y el hígado de los receptores mediante citometría de flujo, qPCR y análisis histológicos. Por lo tanto, la inyección intraperitoneal es un método eficiente de inducción de LMA mediante el trasplante en serie de células leucémicas de donantes.
Introduction
La leucemia mieloide aguda (LMA) es un tipo de neoplasia maligna hematológica de etiología diversa con mal pronóstico1. La generación de modelos animales de LMA sienta las bases para la comprensión de sus complejas variaciones y patobiología en un esfuerzo por descubrir nuevas terapias2. La leucemogénesis en ratones implica el trasplante de células donantes que expresan oncoproteínas de fusión, incluidas las fusiones que involucran el gen de la leucemia de linaje mixto (MLL) para inducir potentemente la LMA, para imitar la enfermedad en humanos3. Se han reportado varios orígenes celulares de células de donantes en el trasplante de LMA4 asociada al gen MLL, y se sabe muy poco sobre las células responsables del origen de la enfermedad.
Se han desarrollado múltiples vías para el trasplante en ratones; en lugar de una inyección intrafemoral, que introduce directamente células mutantes del donante en la médula ósea5, una inyección intravenosa que utiliza el plexo sinusal venoso, la vena de la cola y la vena yugular se ha utilizado ampliamente para generar modelos murinos de LMA 6,7,8,9. En el caso de la inyección retroorbitaria (r.o.), varias desventajas inherentes, como la limitación de volumen, la alta demanda técnica, las pocas posibilidades de repetidos intentos o errores, y las posibles lesiones oculares, han sido grandes obstáculos con alternativas limitadas o inviables7. La inyección de venas de la cola puede tener problemas similares además de las lesiones locales; Para facilitar el procedimiento, los ratones a menudo necesitan ser calentados para dilatar sus venas de la cola10. También es difícil localizar la vena de la cola sin una fuente de luz adicional, particularmente en la cepa de ratones C57BL / 6. Para la inyección de vena yugular, el personal de investigación requiere suficiente capacitación para localizar la vena y limitar las posibles complicaciones. Además, tanto las inyecciones de seno venoso como las de venas yugulares deben realizarse bajo anestesia, lo que agrega otro nivel de complejidad. Por lo tanto, es tentador explorar nuevas rutas de trasplante para facilitar el establecimiento de modelos murinos de LMA.
La inyección intraperitoneal (i.p.) se usa comúnmente para administrar medicamentos, colorantes y anestésicos 11,12,13,14,15; También se ha utilizado para introducir células hematopoyéticas para la hematopoyesis ectópica16 y para trasplantar células madre mesenquimales derivadas de médula ósea en varios modelos de ratón17,18,19,20,21. Sin embargo, se ha utilizado con poca frecuencia para establecer neoplasias malignas hematopoyéticas en ratones, particularmente para estudiar la progresión de la enfermedad de LMA.
El presente estudio describe la viabilidad de la inyección i.p. en la generación de modelos de ratón LMA, además de comparar la eficiencia del trasplante de poblaciones de linaje negativo (Lin-) y Lin-Sca-1+c-Kit+ (LSK) como células donantes. Estos hallazgos proporcionan una manera simple y eficiente de generar modelos experimentales de AML y leucemias mieloides relacionadas. Tal método tiene el potencial de ampliar nuestra comprensión de los mecanismos de la enfermedad, así como proporcionar un modelo relativamente fácil para probar terapias experimentales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Estos estudios descritos anteriormente proporcionan evidencia de apoyo de que el trasplante de células Lin es comparable a las células LSK en la generación de LMA murina de 1°. Además, los datos actuales también muestran que la inyección i.p. es un método eficiente y conveniente para establecer la LMA murina en comparación con la inyección intravenosa (o r.o.).
Además de las células LSK, se ha informado que otras poblaciones como el progenitor granulocítico-monocitos (G…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a la Instalación Central de Citometría de Flujo del Instituto Huck y a la Instalación Central de Histopatología del Laboratorio de Diagnóstico Animal, Departamento de Ciencias Veterinarias y Biomédicas, Universidad Estatal de Pensilvania, por brindar apoyo técnico oportuno. Este trabajo fue apoyado por subvenciones del Instituto Americano para la Investigación del Cáncer (KSP), Penn State College of Agricultural Sciences, Penn State Cancer Institute, USDA-NIFA project 4771, Número de Acceso 00000005 a K.S.P. y R.F.P.
Materials
| a-Select competent cells | Bioline | BIO-85027 | |
| Ammonium chloride (NH4Cl) | Sigma Aldrich | Cat# A-9434 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | Cat# A0797 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA), Fraction V—Low-Endotoxin Grade | Gemini bio-products | Cat# 700-102P | |
| Ciprofloxacin HCl | GoldBio.com | Cat# C-861-100 | |
| DMEM, high glucose, no glutamine | Gibco | Cat# 11960-044 | |
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (PBS) | Corning | Cat# 21-031-CV | |
| EDTA, Disodium Salt (EDTA-2Na), Dihydrate, Molecular Biology Grade | Calbiochem | Cat# 324503 | |
| Fetal Bovine Serum – Premium Select | Atlanta Biologicals | Cat# S11550 | |
| Holo-transferrin, bovine | Sigma Aldrich | Cat# T1283 | |
| Insulin solution human | Sigma | Cat# I-9278 | |
| Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Gibco | Cat# 12440-053 | |
| L-glutamine 200 mM (100×) solution | HyClone, Gelifesciences | Cat# SH30034.01 | |
| LB broth, Lennox | NEOGEN | Cat #: 7290A | |
| LB Broth with agar (Miller) | Sigma Aldrich | Cat# L-3147 | |
| Mouse anti-mouse CD45.1 (FITC) | Miltenyi Biotec | Cat# 130-124-211 | |
| Mouse Interleukin-3 (IL-3) | Gemini bio-products | Cat# 300-324P | |
| Mouse Interleukin-6 (IL-6) | Gemini bio-products | Cat# 300-327P | |
| Mouse Stem Cell Factor (SCF) | Gemini bio-products | Cat# 300-348P | |
| Penicillin-Streptomycin Solution, 100x | Corning | Cat# 30-002-CI | |
| Phenix-Eco (pECO) cells | ATCC | CRL-3214 | |
| Potassium Bicarbonate (KHCO3), Granular | JT. Baker | Cat# 2940-01 | |
| Rat anti-mouse CD117 (c-kit) (APC) | BioLegend | Cat # 105812 | |
| Rat anti-mouse Ly-6A/E (Sca-1) (PE-Cy7) | BD Pharmingen | Cat# 558162 | |
| Recombinant Murine Flt3-Ligand | Pepro Tech, INC. | Cat# 250-31L | |
| RetroNectin Recombinant Human Fibronectin Fragment | TaKaRa | Cat# T100A | |
| TransIT-293 Reagent | MirusBio | Cat# MIR 2705 | |
| TRI Reagent | Sigma Aldrich | Cat# T9424 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Gibco | Cat # 15250061 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | Gibco | Cat# 25200-056 | |
| β-Mercaptoethanol (BME) | Sigma Aldrich | Cat# M3148 | |
| Commercial Assays | |||
| EasySep Mouse Hematopoietic Progenitor Cell Isolation Kit | StemCell technologies | Cat# 19856A | |
| High-Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Thermo Fisher | Cat# 4368813 | |
| PerfeCTa qPCR SuperMix | Quanta Bio | Cat# 95051-500 | |
| Plasmid Maxi Kit (25) | Qiagen | Cat#:12163 | |
| Animals | |||
| Ai14TdTomato mice | Jackson Laboratory | Strain # 007914 | |
| CD45.1 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 002014 | |
| CD45.2 C57BL6/J mice | Jackson Laboratory | Strain # 000664 | |
| Instruments and Softwares | |||
| Adobe illustrator | Version 25.2.3 | ||
| BD accuri C6 flow cytometer | BD Biosciences | ||
| FlowJo 10.8.0 | BD | ||
| GeneSys software program | Version 1.5.7.0 | ||
| GraphPad Prism version 6 | GraphPad | ||
| Hemavet 950FS | Drew Scientific | ||
| 7300 Real time PCR system | Applied Biosystems | ||
| Syngene G:BOX Chemi XR5 Chemiluminescence Fluorescence Imaging | G:Box Chemi |
Referenzen
- Dohner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D. Acute myeloid leukemia. The New England Journal of Medicine. 373 (12), 1136-1152 (2015).
- Fortier, J. M., Graubert, T. A. Murine models of human acute myeloid leukemia. Cancer Treatment and Research. 145, 183-196 (2010).
- Ernst, P., et al. Definitive hematopoiesis requires the mixed-lineage leukemia gene. Developmental Cell. 6 (3), 437-443 (2004).
- Fisher, J. N., Kalleda, N., Stavropoulou, V., Schwaller, J. The Impact of the cellular origin in acute myeloid leukemia: learning from mouse models. Hemasphere. 3 (1), 152 (2019).
- Zhan, Y., Zhao, Y. Hematopoietic stem cell transplant in mice by intra-femoral injection. Methods in Molecular Biology. 430, 161-169 (2008).
- Price, J. E., Barth, R. F., Johnson, C. W., Staubus, A. E. Injection of cells and monoclonal antibodies into mice: comparison of tail vein and retroorbital routes. Proceedings of the Society for Experimental Biology. 177 (2), 347-353 (1984).
- Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. Retro-orbital injections in mice. Lab Animal. 40 (5), 155-160 (2011).
- Suckow, M. A., Danneman, P., Brayton, C. . The Laboratory Mouse. , (2001).
- Barr, J. E., Holmes, D. B., Ryan, L. J., Sharpless, S. K. Techniques for the chronic cannulation of the jugular vein in mice. Pharmacology, Biochemistry, and Behavior. 11 (1), 115-118 (1979).
- Kang, Y. Analysis of cancer stem cell metastasis in xenograft animal models. Methods in Molecular Biology. 568, 7-19 (2009).
- Nungestee, W., Wolf, A., Jourdonais, L. Effect of gastric mucin on virulence of bacteria in intraperitoneal injections in the mouse. Proceedings of the Society for Experimental Biology and Medicine. 30 (2), 120-121 (1932).
- Gargiulo, S., et al. Mice anesthesia, analgesia, and part I: anesthetic considerations in preclinical research. ILAR journal. 53 (1), 55-69 (2012).
- Leong, S. -. K., Ling, E. -. A. Labelling neurons with fluorescent dyes administered via intravenous, subcutaneous or intraperitoneal route. Journal of Neuroscience Methods. 32 (1), 15-23 (1990).
- Ma, P., et al. Intraperitoneal injection of magnetic Fe3O4-nanoparticle induces hepatic and renal tissue injury via oxidative stress in mice. International Journal of Nanomedicine. 7, 4809-4918 (2012).
- Schwarze, S. R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., Dowdy, S. F. In vivo protein transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science. 285 (5433), 1569-1572 (1999).
- Muench, M. O., Chen, J. C., Beyer, A. I., Fomin, M. E. Cellular therapies supplement: the peritoneum as an ectopic site of hematopoiesis following in utero transplantation. Transfusion. 51, 106-117 (2011).
- Zhao, W., et al. Intravenous injection of mesenchymal stem cells is effective in treating liver fibrosis. World Journal of Gastroenterology. 18 (10), 1048 (2012).
- Yousefi, F., Ebtekar, M., Soleimani, M., Soudi, S., Hashemi, S. M. Comparison of in vivo immunomodulatory effects of intravenous and intraperitoneal administration of adipose-tissue mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE). International Immunopharmacol. 17 (3), 608-616 (2013).
- Cheng, K., et al. Transplantation of bone marrow-derived MSCs improves cisplatinum-induced renal injury through paracrine mechanisms. Experimental and Molecular Pathology. 94 (3), 466-473 (2013).
- Castelo-Branco, M., et al. Intraperitoneal but not intravenous cryopreserved mesenchymal stromal cells home to the inflamed colon and ameliorate experimental colitis. PLoS One. 7 (3), 33360 (2012).
- Bazhanov, N., et al. Intraperitoneally infused human mesenchymal stem cells form aggregates with mouse immune cells and attach to peritoneal organs. Stem Cell Research & Therapy. 7, 27 (2016).
- Liu, Q., Chen, L., Atkinson, J. M., Claxton, D. F., Wang, H. G. Atg5-dependent autophagy contributes to the development of acute myeloid leukemia in an MLL-AF9-driven mouse model. Cell Death & Disease. 7 (9), 2361 (2016).
- Wognum, A. W., Eaves, A. C., Thomas, T. E. Identification and isolation of hematopoietic stem cells. Archives of Medical Research. 34 (6), 461-475 (2003).
- Randall, T. D., Weissman, I. L. Characterization of a population of cells in the bone marrow that phenotypically mimics hematopoietic stem cells: resting stem cells or mystery population. Stem Cells. 16 (1), 38-48 (1998).
- Gott, K. M., et al. A comparison of Cs-137 gamma rays and 320-kV X-rays in a mouse bone marrow transplantation model. Dose Response. 18 (2), 1559325820916572 (2020).
- Miner, N. A., Koehler, J., Greenaway, L. Intraperitoneal injection of mice. Applied Microbiology. 17 (2), 250-251 (1969).
- Madisen, L., et al. A robust and high-throughput Cre reporting and characterization system for the whole mouse brain. Nature Neuroscience. 13 (1), 133-140 (2010).
- Cardiff, R. D., Miller, C. H., Munn, R. J. Manual hematoxylin and eosin staining of mouse tissue sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2014 (6), 655-658 (2014).
- Ronan, J. L., Wu, W., Crabtree, G. R. From neural development to cognition: unexpected roles for chromatin. Nature Review Genetics. 14 (5), 347-359 (2013).
- Qian, F., et al. Interleukin-4 treatment reduces leukemia burden in acute myeloid leukemia. FASEB Journal. 36 (5), 22328 (2022).
- Krivtsov, A. V., et al. Transformation from committed progenitor to leukaemia stem cell initiated by MLL-AF9. Nature. 442 (7104), 818-822 (2006).
- Chen, W., et al. Malignant transformation initiated by Mll-AF9: gene dosage and critical target cells. Cancer Cell. 13 (5), 432-440 (2008).
- Somervaille, T. C. P., Cleary, M. L. Identification and characterization of leukemia stem cells in murine MLL-AF9 acute myeloid leukemia. Cancer Cell. 10 (4), 257-268 (2006).
