Stub1 매개 Pexophagy 모니터링
Summary
이 프로토콜은 살아있는 세포에서 Stub1 매개 pexophagy를 트리거하고 모니터링하기 위한 지침을 제공합니다.
Abstract
포유류 세포는 Stub1 매개 pexophagy를 통해 과산화소체를 뒤집을 수 있습니다. 이 경로는 잠재적으로 과산화소체의 양과 질에 대한 세포 제어를 허용합니다. 이 과정에서 열 충격 단백질 70과 유비퀴틴 E3 리가아제인 Stub1은 과산화소체로 전위되어 펙소파지를 시작합니다. Stub1 리가제 활성은 표적 과산화소체에 유비퀴틴 및 기타 자가포식 관련 모듈의 축적을 허용합니다. 퍼옥시좀 루멘 내에서 활성 산소종(ROS) 수준을 높이면 Stub1 매개 축척을 활성화할 수 있습니다. 따라서 염료 보조 ROS 생성을 사용하여 이 경로를 트리거하고 모니터링할 수 있습니다. 이 기사에서는 포유류 세포 배양 내에서 펙소파지를 시작하기 위해 형광 단백질과 합성 형광단의 두 가지 종류의 염료를 사용하는 절차를 간략하게 설명합니다. 이러한 염료 보조 ROS 생성 기반 프로토콜은 전 세계적으로 세포 집단 내의 모든 과산화소체를 표적으로 삼는 데 사용할 수 있을 뿐만 아니라 단일 세포 내에서 개별 과산화소체의 조작을 허용할 수도 있습니다. 또한 생세포 현미경을 사용하여 Stub1 매개 pexophagy를 추적하는 방법도 설명합니다.
Introduction
과산화소체는 대부분의 진핵 세포에 존재하는 단일 막 결합 소기관입니다. 과산화소체는 매우 긴 사슬 지방산의 베타 산화, 퓨린 이화 작용, 에테르 인지질 및 담즙산 합성을 수행하는 데 필수적인 대사 구획입니다1. 과산화소체 유래 아세틸-CoA는 대사에서 중추 신호 전달을 조절하여 지질 항상성을 조절합니다2. 따라서 손상된 과산화소체 기능이 신경퇴행성 장애, 노화, 암, 비만 및 당뇨병을 포함한 다양한 질병에 내포되어 있다는 것은 놀라운 일이 아닙니다 3,4,5. 퍼옥시솜 작동의 유지에 필수적인 과정은 pexophagy입니다. Pexophagy는 autophagy에 의한 peroxisomes의 선택적 회전율을위한 이화 작용 과정입니다. 세포는 펙소파지를 사용하여 과산화소체의 양과 질을 조절하여 적절한 과산화소체 기능을 보장합니다. 최근 연구에 따르면 PEX1 퍼옥시좀 생물 발생 인자 1 및 6의 돌연변이로 인한 과산화소체 손실은 제어되지 않은 pexophagy6의 결과입니다. 특히, 모든 과산화소체 생물발생 장애(PBD) 환자의 65%는 포유류 세포에서 PEX1, PEX6 및 PEX26으로 구성된 과산화소체 AAA ATPase 복합체의 결핍을 가지고 있다7.
pexophagy를 시작하고 연구하기 위해 여러 가지 방법을 사용할 수 있습니다. 효모에서 pexophagy는 공급된 영양소가 과산화소체 의존성 탄소원에서 과산화소체 비의존성 탄소원(세포 과산화소체 수를 낮추기 위해)으로 전환될 때 촉발됩니다.8. 예를 들어, 메탄올-성장한 Pichia pastoris 세포를 메탄올 배지로부터 글루코스 배지 및 에탄올 배지로 옮기는 것은 각각 미세 펙소파지 및 마크로펙소파지를 유도한다 8,9,10. Micropexophagy 격리기는 액포를 리모델링하여 컵 모양의 액포 격리 막과 미세 포식식 특이적 막 장치(MIPA)라고 하는 뚜껑 모양의 구조를 형성함으로써 분해를 위해 클러스터링된 과산화소체를 클러스터링했습니다. macropexophagy에서, 개별 peroxisomes는 pexophagosomes로 알려진 이중 막 구조에 의해 삼켜지고, 분해를 위해 액포와 융합됩니다 8,9,10. 사카로미세스 세레비시아(Saccharomyces cerevisiae)의 Atg36p 및 피키아 파스토리스(Pichia pastoris)의 Atg30p와 같은 엑소포지(pexophagy) 수용체의 인산화는 수용체가 핵심 자가포식 기계를 모집하고 자가포식소체 8,11에 대한 과산화소체 표적화를 촉진하는 데 중요합니다.
포유류 세포에서, pexophagy는 유비퀴틴화에 의해 유도 될 수있다. 퍼옥시좀 막 단백질 PMP34 또는 PEX3에 세포질 측의 유비퀴틴을 태깅하면 pexophagy가 유도됩니다12. PEX3의 과발현은 리소좀에 의한 과산화소체 유비퀴틴화 및 과산화소체 제거를 유도한다13. 또한, PEX5와 C-말단 EGFP의 융합은 모노유비퀴틴화 PEX5의 수출을 손상시키고 펙소파지14를 초래한다. 한편, pexophagy는 또한 H 2 O2처리에 의해 유발 될 수 있습니다. 과산화소체는 활성 산소 종(ROS)을 생성합니다. 특히, 매우 긴 사슬 지방산 (> 22 탄소)의 베타 산화의 초기 단계를 촉매하는 퍼 옥시 솜 효소 Acox1은 아세틸 -CoA뿐만 아니라 퍼 옥시 솜 ROS도 생성합니다. H2O2 처리 하에서 증가된 ROS수준에 반응하여, 포유동물 세포는 ROS 생산을 낮추고 스트레스를 완화하기 위해 펙소파지를 활성화시킨다. H2O2 치료는 모세혈관확장증 변이된 운동실조증(ATM)을 과산화소체로 모집하는 것으로 보고되었습니다. 그런 다음 ATM은 PEX5를 인산화하여 pexophagy15에 의한 과산화소체 회전율을 촉진합니다.
과산화소체는 ROS 생성 센터이기 때문에 ROS 손상이 발생하기 쉽습니다. ROS로 유도된 과산화소체 손상은 세포가 과산화소체 품질 관리 경로(자가포식에 의해 손상된 과산화소체 제거)를 시작하기 위해 축과를 활성화하도록 합니다. 여기에서는 ROS로 유도된 과산화소체 손상의 주문형 트리거링에 대한 접근 방식을 간략하게 설명합니다. 이 프로토콜은 세포 소기관 16,17,18,19,20 내에서 광 활성화 ROS 생산을 활용합니다(그림 1). 염료 표지된 과산화소체가 조명되어 과산화소체 내강 내에서 ROS 생성을 유도하며, 이는 특히 과산화소체 손상을 유발합니다. 이 프로토콜을 사용하여 ROS 스트레스 과산화소체가 유비퀴틴 의존성 분해 경로를 통해 제거되는 것으로 나타났습니다. ROS 스트레스 과산화소체는 유비퀴틴 E3 리가제 Stub1을 모집하여 엑소포지에 의한 개별 제거를 위해 자가포식소체로 삼킬 수 있도록 합니다16. 이 프로토콜을 사용하여 타임랩스 현미경으로 동일한 세포 내에서 손상되고 건강한 과산화소체의 운명을 비교할 수 있습니다. 이 방법은 또한 배양 접시의 모든 과산화소체(모든 세포에서)를 전체적으로 손상시키는 데 사용할 수 있어 축식성 경로의 생화학적 분석이 가능합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 프로토콜은 빛으로 퍼옥시좀 ROS 수준을 높여 세포 배양 내에서 Stub1 매개 pexophagy를 유발하는 방법을 자세히 설명합니다. 이 프로토콜은 염료 보조 ROS 생성에 의존하기 때문에 관심 세포 내에서 diKillerRed-VKSKL 또는 염료 표지 SLP 리간드 염색의 충분한 발현을 보장해야 합니다. 서로 다른 세포 유형 또는 서로 다른 유전적 배경을 가진 세포가 약간 다른 특성을 가진 과산화소체를 보유할 수 있다는 …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 대만 국립 과학 기술위원회 (National Science and Technology Council)의 MOST 111-2311-B-001-019-MY3 연구 보조금으로 부분적으로 지원되었습니다.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
Referenzen
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