Monitorización de la pexofagia mediada por Stub1
Summary
Este protocolo proporciona instrucciones para desencadenar y monitorear la pexofagia mediada por Stub1 en células vivas.
Abstract
Las células de mamíferos pueden voltear los peroxisomas a través de la pexofagia mediada por Stub1. La vía potencialmente permite el control celular de la cantidad y calidad de los peroxisomas. Durante este proceso, la proteína de choque térmico 70 y la ubiquitina E3 ligasa, Stub1, se translocan en los peroxisomas para ser volteados para iniciar la pexofagia. La actividad de la ligasa Stub1 permite la acumulación de ubiquitina y otros módulos relacionados con la autofagia en peroxisomas específicos. La elevación de los niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS) dentro de la luz peroxisomal puede activar la pexofagia mediada por Stub1. Por lo tanto, se puede utilizar la generación de ROS asistida por colorante para desencadenar y monitorear esta vía. Este artículo describe los procedimientos para usar dos clases de colorantes, proteínas fluorescentes y fluoróforos sintéticos, para iniciar la pexofagia dentro de cultivos celulares de mamíferos. Estos protocolos basados en la generación de ROS asistidos por colorante no solo se pueden usar para atacar todos los peroxisomas dentro de una población celular a nivel mundial, sino que también pueden permitir la manipulación de peroxisomas individuales dentro de células individuales. También describimos cómo se puede seguir la pexofagia mediada por Stub1 utilizando microscopía de células vivas.
Introduction
Los peroxisomas son orgánulos unidos a una sola membrana presentes en la mayoría de las células eucariotas. Los peroxisomas son un compartimento metabólico esencial para llevar a cabo la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga, catabolismo de purina y síntesis de fosfolípidos y ácidos biliareséter 1. La acetil-CoA derivada de peroxisomas controla la homeostasis lipídica regulando la señalización central en el metabolismo2. Por lo tanto, no es de extrañar que las funciones peroxisomales comprometidas estén implicadas en diversas enfermedades, incluyendo trastornos neurodegenerativos, envejecimiento, cáncer, obesidad y diabetes 3,4,5. Un proceso esencial en el mantenimiento de la operación peroxisomal es la pexofagia. La pexofagia es un proceso catabólico para el recambio selectivo de peroxisomas por autofagia. Las células utilizan la pexofagia para ayudar a controlar la cantidad y calidad de los peroxisomas, asegurando así una función peroxisomal adecuada. Un estudio reciente demostró que la pérdida de peroxisomas causada por mutaciones en los factores de biogénesis peroxisomal PEX1 1 y 6 resulta de la pexofagia no controlada6. En particular, el 65% de todos los pacientes con trastorno de biogénesis de peroxisomas (PBD) albergan deficiencias en el complejo ATPasa AAA peroxisomal, compuesto por PEX1, PEX6 y PEX26 en células de mamíferos7.
Se pueden utilizar varios métodos para iniciar y estudiar la pexofagia. En la levadura, la pexofagia se desencadena cuando los nutrientes suministrados se cambian de fuentes de carbono dependientes del peroxisoma a fuentes de carbono independientes del peroxisoma (para reducir el número de peroxisomas celulares)8. Por ejemplo, la transferencia de células de Pichia pastoris cultivadas con metanol del medio metanol al medio de glucosa y al medio de etanol induce micropexofagia y macropexofagia, respectivamente 8,9,10. Los secuestros de micropexofagia agrupan los peroxisomas para su degradación mediante la remodelación de la vacuola para formar membranas de secuestro vacuolar en forma de copa y una estructura similar a una tapa denominada aparato de membrana específico de micropexofagia (MIPA). En la macropexofagia, los peroxisomas individuales son engullidos por estructuras de doble membrana conocidas como pexofagosomas, seguidas de fusión con la vacuola para la degradación 8,9,10. La fosforilación de receptores de pexofagia, como Atg36p en Saccharomyces cerevisiae y Atg30p en Pichia pastoris, es crítica para que los receptores recluten maquinaria central de autofagia y faciliten la orientación peroxisomal a los autofagosomas 8,11.
En las células de mamíferos, la pexofagia puede ser inducida por ubiquitinación. El marcado de las proteínas de membrana peroxisomal PMP34 o PEX3 con ubiquitina en el lado citosólico induce pexofagia12. La sobreexpresión de PEX3 induce la ubiquitinación de los peroxisomas y la eliminación de los peroxisomas por los lisosomas13. Además, la fusión de PEX5 con un EGFP C-terminal perjudica la exportación de PEX5 monoubiquitinado y da lugar a pexofagia14. Por otro lado, la pexofagia también puede ser desencadenada por el tratamiento conH2O2. Los peroxisomas producen especies reactivas de oxígeno (ROS); específicamente, la enzima peroxisomal Acox1, que cataliza el paso inicial de la beta-oxidación de ácidos grasos de cadena muy larga (> 22 carbono), produce no solo acetil-CoA sino también ROS peroxisomal. En respuesta a los niveles elevados de ROS bajo el tratamiento conH2O2, las células de mamíferos activan la pexofagia para reducir la producción de ROS y aliviar el estrés. Se ha informado que el tratamiento conH2O2impulsa el reclutamiento de ataxia-telangiectasia mutada (ATM) a peroxisomas. ATM luego fosforila PEX5 para promover el recambio peroxisomal por pexofagia15.
Dado que los peroxisomas son centros generadores de ROS, también son propensos al daño de ROS. Las lesiones peroxisomales provocadas por ROS obligan a las células a activar la pexofagia para iniciar las vías de control de calidad del peroxisoma (eliminación del peroxisoma dañado por autofagia). Aquí, describimos un enfoque para el desencadenamiento a demanda de la lesión peroxisomal provocada por ROS. El protocolo aprovecha la producción de ROS activadas por luz dentro de los orgánulos 16,17,18,19,20 (Figura 1). Los peroxisomas marcados con colorante se iluminan, lo que lleva a la producción de ROS dentro de la luz peroxisomal, lo que desencadena específicamente la lesión peroxisomal. Usando este protocolo, se muestra que los peroxisomas estresados por ROS se eliminan a través de una vía de degradación dependiente de ubiquitina. Los peroxisomas estresados por ROS reclutan la ubiquitina E3 ligasa Stub1 para permitir su inmersión en autofagosomas para su eliminación individual por pexofagia16. Se puede usar este protocolo para comparar el destino de los peroxisomas lesionados y sanos dentro de la misma célula mediante microscopía de lapso de tiempo. El método también se puede utilizar para dañar globalmente todos los peroxisomas (en todas las células) en una placa de cultivo, lo que permite el análisis bioquímico de la vía de pexofagia.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo detalla cómo desencadenar la pexofagia mediada por Stub1 dentro de cultivos celulares elevando los niveles de ROS peroxisomales con luz. Como el protocolo se basa en la generación de ROS asistida por colorante, es necesario garantizar una expresión suficiente de diKillerRed-VKSKL o tinción de ligando SLP marcada con colorante dentro de las células de interés. Dado que diferentes tipos de células o células de diferentes antecedentes genéticos pueden albergar peroxisomas con propiedades ligeramente …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado en parte por una beca de investigación MOST 111-2311-B-001-019-MY3 del Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de Taiwán.
Materials
| 35 mm culture dish with a 20 mm diameter glass microwell | MatTek | P35G-1.5-20-C | 20 mm glass bottomed |
| 3-amino-1,2,4-triazole (3-AT) | Sigma Aldrich | A8056 | |
| bovine serum | ThermoFisher Scientific | 16170060 | |
| Cell culture incubator | Nuaire | NU-4750 | |
| diKillerRed-PTS1 | Academia Sinica | made by appending the KillerRed tandem dimer with PTS1(VKSKL) | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | ThermoFisher Scientific | 11965092 | |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F-12) | ThermoFisher Scientific | 11330032 | |
| EGFP-C1 | Clontech | pEGFP-C1 | The backbone of EGFP-C1 was used for cloning EGFP-Stub1, EGFP-Hsp70, EGFP-p62 |
| EGFP-Hsp70 | Academia Sinica | Hsp70 gene (HSPA1A) PCR amplified from HeLa cDNA and cloned into EGFP-C1 | |
| EGFP-LC3B | Addgene | 11546 | |
| EGFP-p62 | Academia Sinica | generated by inserting the human SQSTM1 gene (through PCR amplification of the HeLa cell cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Stub1 | Academia Sinica | generated by inserting the mouse Stub1 gene (through PCR amplification of the total mouse kidney cDNA) into EGFP-C1 | |
| EGFP-Ub | Addgene | 11928 | |
| fetal bovine serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| HaloTag TMR ligand | Promega | G8252 | |
| HaloTag-PTS1 | Academia Sinica | PTS1 appended and cloned into EGFP-C1 backbone | |
| HEPES | ThermoFisher Scientific | 15630080 | |
| Inverted Confocal Microscope | Olympus | FV3000RS | 405 nm Ex, 488 nm Ex, 561 nm Ex, microscope with a TOKAI HIT chamber incubator and the UNIV2-D35 dish attachment |
| Janelia Fluor 646 HaloTag Ligand | Promega | GA1120 | |
| LED | VitaStar | PAR64 | 80 W, 555-570 nm |
| lipofectamine 2000 | ThermoFisher Scientific | 11668 | transfection reagent |
| NIH3T3 cell | ATCC | CRL-1658 | adherent |
| Opti-MEM | ThermoFisher Scientific | 319850 | reduced serum media |
| penicillin/streptomycin | ThermoFisher Scientific | 15140 | |
| PMP34-TagBFP | Academia Sinica | PMP34 PCR amplified from HeLa cDNA and cloned intoTagBFP-C (Evrogen FP171) | |
| roGFP2-PTS1 | Academia Sinica | generated by appending eroGFP (taken from Addgene plasmid 20131) with the amino acid sequence VKSKL, and cloned into the EGFP-C1 | |
| SHSY5Y cell | ATCC | CRL-2266 | adherent |
Referenzen
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