نقدم بروتوكولا لتصور الأنشطة الأيضية مباشرة في الخلايا التي تنظمها الأحماض الأمينية باستخدام المجهر المجهري لتشتت رامان المحفز(DO-SRS) ، والذي يتكامل مع المجهر الفلوري ثنائي الفوتون (2PEF).
الأحماض الأمينية العطرية الأساسية (AAAs) هي اللبنات الأساسية لتوليف كتل حيوية جديدة في الخلايا والحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية. على سبيل المثال ، يعد الإمداد الوفير من AAAs مهما للخلايا السرطانية للحفاظ على نموها السريع وانقسامها. مع هذا ، هناك طلب متزايد على نهج تصوير محدد للغاية وغير جراحي مع الحد الأدنى من تحضير العينات لتصور مباشر لكيفية تسخير الخلايا ل AAAs لعملية التمثيل الغذائي في الموقع. هنا ، نقوم بتطوير منصة تصوير بصري تجمع بين فحص أكسيد الديوتيريوم (D2O) مع تشتت رامان المحفز (DO-SRS) وتدمج DO-SRS مع مضان إثارة الفوتون (2PEF) في مجهر واحد لتصور الأنشطة الأيضية لخلايا HeLa مباشرة تحت تنظيم AAA. بشكل جماعي ، توفر منصة DO-SRS دقة مكانية عالية وخصوصية للبروتينات والدهون المركبة حديثا في وحدات خلايا HeLa المفردة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لطريقة 2PEF اكتشاف إشارات التألق الذاتي للنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) والفلافين بطريقة خالية من الملصقات. يتوافق نظام التصوير الموصوف هنا مع كل من النماذج في المختبر وفي الجسم الحي ، وهو مرن للتجارب المختلفة. يتضمن سير العمل العام لهذا البروتوكول زراعة الخلايا ، وإعداد وسائط الثقافة ، ومزامنة الخلايا ، وتثبيت الخلية ، وتصوير العينات باستخدام طرائق DO-SRS و 2PEF.
كونها أحماض أمينية عطرية أساسية (AAAs) ، يمكن أن يمتصها جسم الإنسان من الفينيل ألانين (Phe) والتريبتوفان (Tryp) لتجميع جزيئات جديدة للحفاظ على الوظائف البيولوجية الطبيعية1. هناك حاجة إلى Phe لتخليق البروتينات والميلانين والتيروزين ، في حين أن Tryp مطلوب لتخليق الميلاتونين والسيروتونين والنياسين2،3. ومع ذلك ، فإن الاستهلاك الزائد لهذه AAAs يمكن أن ينظم هدف الثدييات لمسار rapamycin (mTOR) ، ويمنع كيناز البروتين المنشط AMP ، ويتداخل مع استقلاب الميتوكوندريا ، ويغير بشكل جماعي التخليق الحيوي للجزيء الكبير ويؤدي إلى إنتاج السلائف الخبيثة ، مثل أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) في الخلايا السليمة4،5،6. يعد التصور المباشر لديناميكيات التمثيل الغذائي المتغيرة في ظل تنظيم AAA الزائد أمرا ضروريا لفهم أدوار AAAs في تعزيز تطور السرطان ونمو الخلايا السليمة7،8،9.
تعتمد دراسات AAA التقليدية على كروماتوغرافيا الغاز (GC)10. الطرق الأخرى ، مثل التصوير بالرنين المغناطيسي (MRI) ، لها دقة مكانية محدودة ، مما يجعل من الصعب إجراء التحليل الخلوي ودون الخلوي للعينات البيولوجية11. في الآونة الأخيرة ، تم تطوير الامتزاز / التأين بالليزر بمساعدة المصفوفة (MALDI) لتوضيح دور AAAs في تخليق الدهون والبروتين في انتشار السرطان باستخدام المؤشرات الحيوية غير الغازية12،13،14. ومع ذلك ، لا تزال هذه التقنية تعاني من أعماق التصوير الضحلة ، وضعف الدقة المكانية ، وإعداد العينات على نطاق واسع. على المستوى الخلوي ، يمكن تتبع النظائر المستقرة غير السامة ، مثل النيتروجين -15 والكربون -13 ، من خلال التصوير متعدد النظائر وقياس الطيف الكتلي الأيوني الثانوي النانوي لفهم اندماجها في الجزيئات الكبيرة. ومع ذلك ، فإن هذه الطرق مدمرة للعينات البيولوجية الحية15,16. مجهر القوة الذرية (AFM) هو تقنية قوية أخرى يمكنها تصور ديناميكيات التمثيل الغذائي17. من ناحية أخرى ، قد يتسبب المعدل البطيء للمسح أثناء تصوير AFM في تشويه الصورة للنتيجة الناتجة عن الانجراف الحراري.
لقد طورنا طريقة تصوير ثنائية التعامد غير جراحية عن طريق اقتران المجهر بأكسيد الديوتيريوم (D2O) الذي تم فحصه بفحص تشتت رامان المحفز (DO-SRS) والفحص المجهري الفلوري ثنائي الفوتون الخالي من الملصقات (2PEF). تحقق هذه الطريقة دقة مكانية عالية وخصوصية كيميائية عند تصوير العينات البيولوجية18،19،20،21،22،23،24. يقدم هذا البروتوكول تطبيقات DO-SRS و 2PEF لفحص الديناميات الأيضية للدهون والبروتين وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال أثناء تطور السرطان. نظرا لكون D2O شكلا مستقرا من نظائر الماء ، يمكن تمييز الجزيئات الحيوية الخلوية بالديوتيريوم (D) بسبب تعويضه السريع مع إجمالي ماء الجسم في الخلايا ، وتشكيل روابط الكربون والديوتيريوم (C-D) من خلال التبادل الأنزيمي21. يمكن اكتشاف روابط C-D في الجزيئات الكبيرة المركبة حديثا ، بما في ذلك الدهون والبروتينات والحمض النووي / الحمض النووي الريبي والكربوهيدرات ، في المنطقة الصامتة للخلية من طيف رامان20،21،22،25،26،27. مع اثنين من نبضات الليزر المتزامنة ، يمكن عرض روابط C-D للدهون والبروتينات المركبة حديثا على خلايا مفردة عبر التصوير الطيفي (HSI) دون استخراجها أو تمييزها بعوامل سامة للخلايا. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الفحص المجهري SRS لديه القدرة على بناء نماذج ثلاثية الأبعاد (3D) لمناطق مختارة ذات أهمية في العينات البيولوجية من خلال التقاط ودمج مجموعة من الصور المقطعية22,26. مع التصوير الحجمي فائق الطيفية و 3D ، يمكن ل DO-SRS الحصول على توزيعات مكانية للجزيئات الكبيرة المركبة حديثا في خلايا مفردة ، إلى جانب نوع العضيات التي تسهل عملية تعزيز نمو السرطان بموجب لائحة AAA22. علاوة على ذلك ، باستخدام 2PEF ، يمكننا الحصول على إشارات التألق الذاتي للفلافين والنيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد (NADH) بدقة عالية وعمق اختراق عميق وتلف منخفض المستوى في العينات البيولوجية21،23،24. تم استخدام إشارات التألق الذاتي للفلافين و NADH لتوصيف توازن الأكسدة والاختزال وبيروكسيد الدهون في الخلايا السرطانية22,26. على هذا النحو ، لا يوفر اقتران DO-SRS و 2PEF تحليلا تحت خلوي لديناميكيات التمثيل الغذائي التي تنظمها AAA في الخلايا السرطانية ذات التوزيع المكاني العالي ، ومعلومات الخصوصية الكيميائية ، والحد الأدنى من تحضير العينات ، ولكن الطريقة تقلل أيضا من الحاجة إلى استخراج أو تسمية الجزيئات الداخلية بالكواشف السامة. في هذا البروتوكول ، نقدم أولا إجراءات D2O وإعداد الأحماض الأمينية ، وكذلك زراعة الخلايا السرطانية. بعد ذلك ، نعرض بروتوكولات تصوير DO-SRS وتصوير 2PEF. أخيرا ، نقدم النتائج التمثيلية لتصوير SRS و 2PEF ، والتي توضح التغيرات الأيضية التي تنظمها AAA للدهون والبروتين ، وتغيرات نسبة الأكسدة والاختزال في الخلايا السرطانية. يتم تسليط الضوء على توضيح مفصل للعملية في الشكل 1.
تم تطبيق تصوير DO-SRS و 2PEF للتحقيق في ديناميكيات التمثيل الغذائي في نماذج مختلفة خارج الجسم الحي ، بما في ذلك ذبابة الفاكهة والأنسجة البشرية 21،22،23،24،26،27،33. تد…
The authors have nothing to disclose.
نشكر الدكتور ياجوان لي وأنتوني فونغ على دعمهما الفني ، ومختبر فرالي على خط الخلايا. نحن نعترف بأموال بدء التشغيل من UCSD و NIH U54CA132378 و NIH 5R01NS111039 و NIH R21NS125395 و NIHU54DK134301 و NIHU54 HL165443 وجائزة Hellman Fellow Award.
10 mL Serological Pipettes | Avantor (by VWR) | 75816-100 | https://us.vwr.com/store/product?keyword=75816-100 |
15 mL Conical Centrifuge Tube | VWR | 89039-664 | https://mms.mckesson.com/product/1001859/VWR-International-89039-664 |
16% Formaldehyde, Methanol-free | ThermoFisher Scientific | 28906 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/28906 |
24-well plate | Fisherbrand | FB0112929 | https://www.fishersci.com/shop/products/24-well-tc-multidish-100-cs/FB012929#?keyword=FB012929 |
25 mm Syringe Filter, 2 μm PES | Foxx Life Sciences | 381-2216-OEM | https://www.foxxlifesciences.com/collections/pes-syringe-filters/products/381-2216-oem?variant=16274336003 |
460 nm Filter Cube | Olympus | OCT-ET460/50M32 | |
AC Adapters of the Power Supply for LD OBIS 6 Laser Remote | Olympus | Supply power to the laser | |
Band-pass Filter | KR Electronics | KR2724 | 8 MHz |
BNC 50 Ohm Terminator | Mini Circuits | STRM-50 | |
BNC Cable | Thorlabs | 2249-C | Coaxial Cable, BNC Male/Male |
Broadband Dielectric Mirror | Thorlabs | BB1-E03 | 750 – 1100 nm |
Centrifuge | |||
Condenser | Olympus | ||
Cover Glass | Corning | 2850-25 | https://ecatalog.corning.com/life-sciences/b2b/NL/en/Glassware/Cover-Glass/Corning%C2%AE-Square-%231%C2%BD-Cover-Glass/p/2850-25 |
DC power supply | TopWard | 6302D | |
Dichroic Mount | Thorlabs | KM100CL | |
Dimethyl Sulfoxide Cell Culture Reagent | mpbio | 196055 | https://www.mpbio.com/0219605525-dimethyl-sulfoxide-cf |
Dulbecco's Modified Eagle’s Medium without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate | MilliporeSigma | 38210000 | https://www.usbio.net/media/D9800-22/dulbeccorsquos-mem-dmem-wsodium-bicarbonate-wo-methionine-threonine-sodium-pyruvate-powder With Sodium Bicarbonate and without Methionine, Threonine, and Sodium Pyruvate |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Corning | MT10027CV | https://www.fishersci.com/shop/products/dmem-dulbecco-s-modified-eagle-s-medium-4/MT10027CV#:~:text=Dulbecco's%20Modified%20Eagle's%20Medium%20 |
FIJI ImageJ | ImageJ | Version 1.53t 24 August 2022 | https://imagej.net/software/fiji/downloads |
Heavy Water (Deuterium Oxide) | Cambridge Isotope Laboratories, Inc. | 7732-18-5 | https://shop.isotope.com/productdetails.aspx?itemno=DLM-4-1L |
Hela Cells | ATCC | CCL-2 | https://www.atcc.org/products/ccl-2 |
Hemocymeter | MilliporeSigma | Z359629-1EA | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/z359629?gclid=Cj0KCQiA37KbBhDgARIsAI zce15A5FIy0WS7I6ec2KVk QPXVMEqlAnYis_bKB6P6lr SIZ-wAXOyAELIaAhhEEAL w_wcB&gclsrc=aw.ds |
High O.D. Bandpass Filter | Chroma Technology | ET890/220m | Filter the Stokes beam and transmit the pump beam |
HyClone Fetal Bovine Serum (FBS) | Cytiva | SH300880340 | https://www.fishersci.com/shop/products/hyclone-fetal-bovine-serum-u-s-standard-4/SH300880340 |
HyClone Trypsin 0.25% (1x) Solution | Cytiva | SH30042.02 | https://www.cytivalifesciences.com/en/us/shop/cell-culture-and-fermentation/reagents-and-supplements/cell-disassociation-reagents/hyclone-trypsin-protease-p-00445 |
Integrated SRS Laser System | Applied Physics & Electronics, Inc. | picoEMERALD | picoEMERALD provides an output pulse at 1031 nm with 6-ps pulse width and 80-MHz repetition rate, which serves as the Stokes beam. The frequency doubled beam at 532 nm is used to synchronously seed a picosecond optical parametric oscillator (OPO) to produce a mode-locked pulse train with five~6 ps pulse width (the idler beam of the OPO is blocked with an,interferometric filter). The output wavelength of the OPO is tunable from 720–950 nm, which serves as the pump beam. The intensity of the 1031 nm Stokes beam is modulated sinusoidally by a built-in EOM at 8 MHz with a modulation depth of more than 90%. The pump beam is spatially overlapped with the Stokes beam by using a dichroic mirror inside picoEMERALD. The temporal overlap between pump and Stokes pulses are achieved with a built-in delay stage and optimized by the SRS signal of pure D2O at the microscope. |
Inverted Laser-scanning Microscope | Olympus | FV1200MPE | |
IX3-CBH Control box | Olympus | Control the laser-scanning microscope | |
Kinematic Mirror Mount | Thorlabs | POLARIS-K1-2AH | 2 Low-Profile Hex Adjusters |
L-Phenalynine | Sigma | P5482-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/p5482 |
L-Tryptophan | Sigma | T8941-25G | https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/t8941 |
LabSpec 6 | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/gbr/scientific/products/detail/action/show/Product/labspec-6-spectroscopy-suite-software-1843/ |
Lock-In Amplifier | Zurich Instruments | N/A | https://www.zhinst.com/americas/en/products/shfli-lock-in-amplifier |
Long-pass Dichroic Beam Splitter | Semrock | Di02-R980-25×36 | 980 nm laser BrightLine single-edge laser-flat dichroic beamsplitter |
MATLAB | MathWorks | Version: R2022b | https://www.mathworks.com/products/new_products/latest_features.html |
Microscope Slides | Fisherbrand | 12-550-003 | https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-selectfrost-microscope-slides-9/12550003#?keyword=12-550-003 |
Microscopy Imaging Software | Olympus | FluoView | |
MPLN 100x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11364 |
MPLN 50x, Olympus | Olympus | MPLAPON | https://www.olympus-ims.com/en/microscope/mplapon/#!cms[focus]=cmsContent11363 |
NA Oil Condenser | Olympus | 6-U130 | https://www.hitechinstruments.com/Product-Details/olympus-achromatic-aplanatic-high-na-condneser |
Nail Polish | Wet n Wild | B01EO2G5O4 | https://www.amazon.com/dp/B01EO2G5O4/ref=cm_sw_r_api_i_E609VVDWW HHQP38FXXDC_0 |
Origin | OriginLab | Origin 2022b (9.95) | https://www.originlab.com/index.aspx?go=PRODUCTS/Origin |
Parafilm | Fisher Scientific | S37440 | https://www.fishersci.com/shop/products/parafilm-m-wrapping-film-3/p-2379782 |
PBS 1x (Dulbecco's Phosphate Buffered Saline) | Thermofischer – Gibco | 14040117 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040117?SID=srch-hj-14040117 |
Penicillin/Streptomycin | Thermofischer – Gibco | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
Periscope Assembly | Thorlabs | RS99 | Includes the top and bottom units, Ø1" post, and clamping fork. |
picoEmerald System | A.P.E | N/A | https://www.ape-berlin.de/en/cars-srs/ |
Shielded Box with BNC Connectors | Pomona Electronics | 2902 | Aluminum Box with Cover, BNC Female/Female |
Si Photodiode Detector | Home Built | N/A | DYI series |
Silicon Wafer | |||
Spacers | Grace Bio-Labs | 654008 | https://gracebio.com/product/secureseal-imaging-spacers-654008/ |
Spontaneous Raman spectroscopy | Horiba XploRA | N/A | https://www.horiba.com/int/products/detail/action/show/Product/xploratm-plus-1528/ |
Stimulated Raman Scattering Microscopy | Home Built | N/A | |
Touch Panel Controller | Olympus | Control the X-Y direction of the laser-scanning microscope | |
Trypan Blue 0.4% (0.85% NaCl) | Lonza | 17-942E | https://bioscience.lonza.com/lonza_bs/US/en/Culture-Media-and-Reagents/p/000000000000181876/Trypan-Blue%2C-0-4%25-Solution" |
Tweezers | Kaverme – Amazon | B07RNVXXV1 | https://www.amazon.com/Precision-Anti-Static-Electronics-Laboratory-Jewelry-Making/dp/B07RNVXXV1" |
Two Photon Excitation Fluorescence Microscopy | Home Built | N/A | |
Weighing Paper | VWR | 12578-165 | https://us.vwr.com/store/product/4597617/vwr-weighing-paper |
Zurich LabOneQ Software | Zurich Instruments | Control the Zurich lock-in amplifier |