Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion
Summary
Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.
Abstract
Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffe haben aufgrund ihrer geringen Partikelgröße, ihrer hohen thermischen Stabilität und ihrer Fähigkeit, gültige Immunreaktionen zu induzieren, große Aufmerksamkeit erregt. Die Etablierung einer Reihe umfassender Protokolle zur Bewertung der Immunantwort eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs ist jedoch von entscheidender Bedeutung. Daher wird in diesem Artikel ein strenges Verfahren zur Bestimmung der physikalisch-chemischen Eigenschaften eines Impfstoffs (mittels Transmissionselektronenmikroskopie [TEM], Rasterkraftmikroskopie [AFM] und dynamischer Lichtstreuung [DLS]), der Stabilität des Impfstoffantigens und -systems (durch einen Hochgeschwindigkeitszentrifugentest, einem thermodynamischen Stabilitätstest, SDS-PAGE und Western Blot) und der spezifischen Immunantwort (IgG1, IgG2a und IgG2b). Mit diesem Ansatz können Forscher die Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs in einem tödlichen MRSA252-Mausmodell genau bewerten. Mit diesen Protokollen kann das vielversprechendste Nanoemulsions-Impfstoff-Adjuvans in Bezug auf das effektive Adjuvanspotenzial identifiziert werden. Darüber hinaus können die Methoden dazu beitragen, neuartige Impfstoffe für die zukünftige Entwicklung zu optimieren.
Introduction
Methicillin-resistenter Staphylococcus aureus (MRSA) ist ein opportunistischer Erreger mit einer der höchsten Infektionsraten auf einer Intensivstation (ICU) Station1, kardiologischen Abteilungen und Verbrennungsabteilungen weltweit. MRSA weist hohe Infektionsraten, Mortalität und breite Arzneimittelresistenzen auf, was eine große klinische Behandlung erschwert2. In der 2017 von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) veröffentlichten globalen Prioritätenliste antibiotikaresistenter Bakterien wurde MRSA in die kritischste Kategorie3 eingestuft. Ein Impfstoff gegen eine MRSA-Infektion wird daher dringend benötigt.
Aluminium-Adjuvans wird seit langem verwendet, und der Hilfsmechanismus des Adjuvans ist relativ klar, sicher, wirksam und gut verträglich4. Aluminium-Adjuvantien sind derzeit eine weit verbreitete Art von Adjuvans. Es wird allgemein angenommen, dass Antigene, die an Aluminiumsalzpartikeln adsorbiert werden, die Stabilität und die Fähigkeit der Injektionsstelle, Antigene aufzunehmen, verbessern können, was zu einer guten Absorption und langsamen Freisetzung führt5. Derzeit besteht der Hauptnachteil von Aluminium-Adjuvantien darin, dass ihnen eine adjuvante Wirkung fehlt oder sie nur eine schwache adjuvante Wirkung auf einige Antigene von Impfstoffkandidaten aufweisen6. Darüber hinaus induzieren Aluminium-Adjuvantien IgE-vermittelte Überempfindlichkeitsreaktionen5. Daher ist es notwendig, neuartige Adjuvantien zu entwickeln, um eine stärkere Immunantwort zu stimulieren.
Nanoemulsions-Adjuvantien sind kolloidale Dispersionssysteme, die aus Öl, Wasser, Tensiden und Cotensiden bestehen7. Darüber hinaus sind die Adjuvantien thermodynamisch stabil und isotrop, können autoklaviert oder durch Hochgeschwindigkeitszentrifugation stabilisiert werden und können unter milden Präparationsbedingungen spontan gebildet werden. Mehrere Emulsionshilfsstoffe (z. B. MF59, NB001-002-Serie, AS01-04-Serie usw.) sind derzeit auf dem Markt oder befinden sich in der klinischen Forschung, aber ihre Partikelgrößen sind größer als 160 nm8. Daher können die Vorteile nanoskaliger (1-100 nm) medizinischer Zubereitungen (d. h. große spezifische Oberfläche, kleine Partikelgröße, Oberflächeneffekt, hohe Oberflächenenergie, kleiner Größeneffekt und Makro-Quantentunneleffekt) nicht voll ausgeschöpft werden. Im vorliegenden Protokoll wurde berichtet, dass ein neuartiges Adjuvans auf Basis der Nanoemulsionstechnologie mit einem Durchmesser von 1-100 nm eine gute Adjuvansaktivität aufweist9. Wir testeten die Rekombinationsuntereinheit Impfstoff-Antigen-Protein HI (α-Hämolysin-Mutante [Hla] und Fe-Ionen-Oberflächen-bestimmender Faktor B [IsdB] Untereinheit N2 aktives Fragment-Fusionsprotein); Es wurde eine Reihe von Verfahren etabliert, um die physikalischen Eigenschaften und die Stabilität zu untersuchen, die spezifische Antikörperantwort nach intramuskulärer Verabreichung zu bewerten und die Schutzwirkung des Impfstoffs anhand eines systemischen Infektionsmodells der Maus zu testen.
Protocol
Representative Results
Discussion
IsdB, ein bakterielles, zellwandverankertes und eisenreguliertes Oberflächenprotein, spielt eine wichtige Rolle bei der Gewinnung von Hämeisen15. Hla, Alpha-Toxin, gehört zu den wirksamsten bakteriellen Toxinen, die bei MRSA bekannt sind, und kann Poren in eukaryotischen Zellen bilden und Adhäsions- und Epithelzellen stören16. In unserer Arbeit wurde ein neuartiges Rekombinations-MRSA-Antigen-Protein (HI) konstruiert und gentechnisch auf Basis der Ant…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, No. 32070924 und 32000651 des NSFC und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing unterstützt.
Materials
| 5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 | Eppendorf, Germany | 5424000495 | |
| 96-well plates | Corning Incorporated, USA | CLS3922 | |
| AFM Dimension FastScan | BRUKER, Germany | null | |
| Alcohol lamp | Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China | YBS-AA-11408 | |
| Balb/c mice | Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. | ||
| BCIP/NBT | Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China | BCIP/NBT | |
| Bio-Rad 6.0 microplate reader | Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA | null | |
| BL21 Competent Cell | Merck millipore,Germany | 70232-3CN | |
| BSA-100G | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
| Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
| Coomassie bright blue G-250 staining solution | MIKX,China | DB236 | |
| Decolorization solution | BOSTER,China | AR0163-2 | |
| Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 | Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China | null | |
| Electrophoresis apparatus | Beijing Liuyi Instrument Factory, China | DYCZ-25D | |
| Gel image | Tanon, USA | null | |
| Glutathione-Sepharose Resin GST | Mei5bio,China | affinity chromatography resin | |
| H2SO4 | Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China | 7664-93-9 | |
| HI recombinant protein | Third Military Medical University,China | 110-27-0 | |
| HRP -Goat Anti-Mouse IgG | Biodragon, China | BF03001 | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG1 | Biodragon, China | BF03002R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2a | Biodragon, China | BF03003R | |
| HRP- Goat anti-mouse IgG2b | Biodragon, China | BF03004R | |
| Inoculation loop | Haimen Feiyue Co.,LTD,China | YR-JZH-1UL | |
| IsdB and Hla clones | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | null | |
| Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) | SEPPIC, France | null | |
| isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside | fdbio,China | FD3278-1 | |
| LB bouillon culture-medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-136 | |
| Lnfrared physiotherapy lamp | Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China | 7600 | |
| Low temperature refrigerated centrifuge | Eppendorf, Germany | null | |
| Malvern NANO ZS | Malvern Instruments Ltd., UK | null | |
| MH(A) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-051 | |
| MH(B) medium | Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China | 02-052 | |
| Micro plate washing machine 405 LSRS | Bio Tek Instruments,Inc Highland Park,USA | null | |
| Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument | BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China | 1658030 | |
| MMC packing | TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD | 0022818 | |
| MRSA252 | USA, ATCC | null | |
| Nanodrop ultraviolet spectrophotometer | Thermo Scientific, USA | null | |
| New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit | DAKEWE, China | 8012011 | |
| PBS | biosharp, China | null | |
| PCR, Amplifier | Thermal Cycler, USA | null | |
| pGEX-target gene recombinant plasmid | Shanghai Jereh Biotechnology Co,China | B3528G | |
| Phosphotungstic acid | G-CLONE, China | CS1231-25g | |
| pipette | Eppendorf, Germany | 3120000844 | |
| polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) | Aladdin, China | K400327-1kg | |
| Primary antibody | Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera | null | See Reference 11 for details |
| propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) | Sigma-Aldrich, USA | P4347-500ML | |
| Protein Marker | Thermo Scientufuc, USA | 26616 | |
| PVDF TRANSFER MEMBRANE | Invitrogen,USA | 88518 | |
| Scanning Electron Microscope | JEOL,Japan | JSM-IT800 | |
| Sodium pentobarbital | Merck,Germany | Tc-P8411 | |
| Talos L120C TEM | Thermo Fisher, USA | null | |
| TMB color solution | TIAN GEN, China | PA107-01 | |
| Turtle kits | Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD | ES80545 | |
| Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 |
Referenzen
- Cheung, G. Y. C., Bae, J. S., Otto, M. Pathogenicity and virulence of Staphylococcus aureus. Virulence. 12 (1), 547-569 (2021).
- Lakhundi, S., Zhang, K. Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: molecular characterization, evolution, and epidemiology. Clinical Microbiology Reviews. 31 (4), e00020 (2018).
- Mancuso, G., Midiri, A., Gerace, E., Biondo, C. Bacterial antibiotic resistance: the most critical pathogens. Pathogens. 10 (10), 1310 (2021).
- Goullé, J. P., Grangeot-Keros, L. Aluminum and vaccines: Current state of knowledge. Medecine et Maladies Infectieuses. 50 (1), 16-21 (2020).
- Shi, S., et al. Vaccine adjuvants: Understanding the structure and mechanism of adjuvanticity. Vaccine. 37 (24), 3167-3178 (2019).
- Geoghegan, S., O’Callaghan, K. P., Offit, P. A. Vaccine safety: myths and misinformation. Frontiers in Microbiology. 11, 372 (2020).
- Pandey, P., Gulati, N., Makhija, M., Purohit, D., Dureja, H. Nanoemulsion: a novel drug delivery approach for enhancement of bioavailability. Recent Patents on Nanotechnology. 14 (4), 276-293 (2020).
- Ko, E. J., Kang, S. M. Immunology and efficacy of MF59-adjuvanted vaccines. Human Vaccines & Immunotherapeutics. 14 (12), 3041-3045 (2018).
- Chen, B. H., Inbaraj, B. S. Nanoemulsion and nanoliposome based strategies for improving anthocyanin stability and bioavailability. Nutrients. 11 (5), 1052 (2019).
- Zuo, Q. F., et al. Evaluation of the protective immunity of a novel subunit fusion vaccine in a murine model of systemic MRSA infection. PLoS One. 8 (12), e81212 (2013).
- Sun, H. W., et al. Induction of systemic and mucosal immunity against methicillin-resistant Staphylococcus aureus infection by a novel nanoemulsion adjuvant vaccine. International Journal of Nanomedicine. 10, 7275-7290 (2015).
- National Pharmacopoeia Committee. . Chinese Pharmacopoeia. , 1088 (2020).
- Kontomaris, S. V., Stylianou, A., Malamou, A. Atomic force microscopy nanoindentation method on collagen fibrils. Materials. 15 (7), 2477 (2022).
- Zeng, H., et al. An immunodominant epitope-specific monoclonal antibody cocktail improves survival in a mouse model of Staphylococcus aureus bacteremia. The Journal of Infectious Diseases. 223 (10), 1743-1752 (2021).
- Roy, U., Kornitzer, D. Heme-iron acquisition in fungi. Current Opinion in Microbiology. 52, 77-83 (2019).
- Saeed, K., et al. Bacterial toxins in musculoskeletal infections. Journal of Orthopaedic Research. 39 (2), 240-250 (2021).
- Xu, Q., Zhou, A., Wu, H., Bi, Y. Development and in vivo evaluation of baicalin-loaded W/O nanoemulsion for lymphatic absorption. Pharmaceutical Development and Technology. 24 (9), 1155-1163 (2019).
- Singh, Y., et al. Nanoemulsion: Concepts, development and applications in drug delivery. Journal of Controlled Release. 252, 28-49 (2017).
- Kadakia, E., Shah, L., Amiji, M. M. Mathematical modeling and experimental validation of nanoemulsion-based drug transport across cellular barriers. Pharmaceutical Research. 34 (7), 1416-1427 (2017).
- Bhattacharjee, S. DLS and zeta potential-What they are and what they are not. Journal of Controlled Release. 235, 337-351 (2016).
- Francis, M. J. Recent advances in vaccine technologies. The Veterinary Clinics of North America. Small Animal Practice. 48 (2), 231-241 (2018).
- Tripathi, N. K., Shrivastava, A. Recent developments in recombinant protein-based dengue vaccines. Frontiers in Immunology. 9, 1919 (2018).
- Wilder-Smith, A. Dengue vaccine development: status and future. Bundesgesundheitsblatt Gesundheitsforschung Gesundheitsschutz. 63 (1), 40-44 (2020).
- Korneev, K. V. Mouse models of sepsis and septic shock. Molekularbiologie. 53 (5), 799-814 (2019).
