Summary

Avaliação da Resposta Imune de uma Vacina Adjuvante em Nanoemulsão Contra a Infecção por Staphylococcus aureus Resistente à Meticilina (MRSA)

Published: September 01, 2023
doi:

Summary

O presente protocolo prepara e avalia as propriedades físicas, a resposta imune e o efeito protetor in vivo de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão.

Abstract

As vacinas adjuvantes em nanoemulsão têm atraído grande atenção devido ao seu pequeno tamanho de partículas, alta estabilidade térmica e capacidade de induzir respostas validamente imunes. No entanto, o estabelecimento de uma série de protocolos abrangentes para avaliar a resposta imune de uma nova vacina adjuvante em nanoemulsão é vital. Portanto, este artigo apresenta um procedimento rigoroso para determinar as características físico-químicas de uma vacina (por microscopia eletrônica de transmissão [MET], microscopia de força atômica [AFM] e espalhamento dinâmico de luz [DLS]), a estabilidade do antígeno e do sistema vacinal (por um teste de centrífuga de alta velocidade, um teste de estabilidade termodinâmica, SDS-PAGE e western blot) e a resposta imune específica (IgG1, IgG2a e IgG2b). Usando essa abordagem, os pesquisadores podem avaliar com precisão o efeito protetor de uma nova vacina adjuvante de nanoemulsão em um modelo de camundongo MRSA252 letal. Com esses protocolos, pode-se identificar o adjuvante vacinal em nanoemulsão mais promissor em termos de potencial adjuvante efetivo. Além disso, os métodos podem ajudar a otimizar novas vacinas para desenvolvimento futuro.

Introduction

Staphylococcus aureus resistente à meticilina (MRSA) é um patógeno oportunista com uma das mais altas taxas de infecção em enfermarias de unidade de terapia intensiva (UTI)1, departamentos de cardiologia e departamentos de queimados em todo o mundo. MRSA apresenta altas taxas de infecção, mortalidade e ampla resistência a drogas, apresentando grandes dificuldades no tratamento clínico2. Na Lista Global Prioritária de Bactérias Resistentes a Antibióticos divulgada pela Organização Mundial da Saúde (OMS) em 2017, o MRSA foi listado na categoria3 mais crítica. Uma vacina contra a infecção por MRSA é, portanto, urgentemente necessária.

O adjuvante de alumínio é utilizado há muito tempo, e o mecanismo auxiliar do adjuvante é relativamente claro, seguro, eficaz e bem tolerado4. Os adjuvantes de alumínio são atualmente um tipo de adjuvante amplamente utilizado. Acredita-se que antígenos adsorvidos em partículas de sal de alumínio possam melhorar a estabilidade e aumentar a capacidade do local de injeção de captar antígenos, proporcionando boa absorção e liberação lenta5. Atualmente, a principal desvantagem dos adjuvantes de alumínio é que eles não têm efeito adjuvante ou exibem apenas um fraco efeito adjuvante sobre alguns antígenos candidatos à vacina6. Além disso, adjuvantes de alumínio induzem reações de hipersensibilidade mediadas por IgE5. Portanto, é necessário desenvolver novos adjuvantes para estimular uma resposta imune mais forte.

Os adjuvantes em nanoemulsão são sistemas de dispersão coloidal compostos por óleo, água, surfactantes e cosurfactantes7. Além disso, os adjuvantes são termodinamicamente estáveis e isotrópicos, podem ser autoclavados ou estabilizados por centrifugação de alta velocidade e podem ser formados espontaneamente sob condições leves de preparação. Vários adjuvantes de emulsão (como MF59, NB001-002 series, AS01-04 series, etc.) estão atualmente no mercado ou em fase de pesquisa clínica, mas seus tamanhos de partículas são superiores a 160 nm8. Portanto, as vantagens das preparações medicinais em nanoescala (1-100 nm) (ou seja, grande área de superfície específica, tamanho de partícula pequeno, efeito de superfície, alta energia de superfície, efeito de tamanho pequeno e efeito de tunelamento macroquântico) não podem ser totalmente exploradas. No presente protocolo, um novo adjuvante baseado na tecnologia de nanoemulsão com um tamanho de diâmetro de 1-100 nm foi relatado como exibindo boa atividade adjuvante9. Testamos a proteína de antígeno vacinal de subunidade de recombinação HI (α-hemolisina mutante [Hla] e fator determinante de superfície do íon Fe B [IsdB] subunidade N2 proteína de fusão de fragmento ativo); Uma série de procedimentos foi estabelecida para examinar as propriedades físicas e a estabilidade, avaliar sua resposta específica de anticorpos após administração intramuscular e testar o efeito protetor da vacina usando um modelo de infecção sistêmica em camundongos.

Protocol

Os experimentos com animais foram conduzidos com base no manual de uso e cuidados com animais de experimentação e foram aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar Animal de Laboratório da Terceira Universidade Militar de Medicina. Camundongos Balb/c fêmeas, com 6-8 semanas de idade, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de fontes comerciais (ver Tabela de Materiais). 1. Preparação da proteína do antígeno MRSA HI …

Representative Results

Avaliou-se o protocolo de preparação da vacina adjuvante em nanoemulsão e os testes in vitro e in vivo desta vacina. MET, AFM e DLS foram usados para determinar as características importantes do potencial zeta e do tamanho de partícula na superfície desta amostra (Figura 1). SDS-PAGE e western blotting mostraram que a quantidade de antígeno no precipitado e sobrenadante não se degradou significativamente após a centrifugação, o que indicou que a vacina estava est…

Discussion

A IsdB, uma proteína de superfície bacteriana ancorada na parede celular e regulada pelo ferro, desempenha um papel importante no processo de obtenção do ferro heme15. A Hla, toxina alfa, está entre as toxinas bacterianas mais eficazes conhecidas em MRSA, podendo formar poros em células eucarióticas e interferir na adesão e nas células epiteliais16. Em nosso estudo, uma nova proteína antigênica (HI) de MRSA de recombinação foi construída e ex…

Offenlegungen

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada pelo No. 2021YFC2302603 do Programa Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento da China, No. 32070924 e 32000651 do NSFC, e No. 2019jcyjA-msxmx0159 do Programa de Projeto da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing.

Materials

5424-Small high speed centrifugeFA-45-24-11 Eppendorf, Germany  5424000495
96-well plates Corning Incorporated, USA CLS3922
AFM Dimension FastScan BRUKER, Germany  null
Alcohol lamp Shenzhen Yibaxun Technology Co.,China YBS-AA-11408
Balb/c mice  Beijing HFK Bioscience Co. Ltd. 
BCIP/NBT Fuzhou Maixin Biotechnology Development Company,China BCIP/NBT
Bio-Rad 6.0 microplate reader Bio-Rad Laboratories Incorporated Limited Co., CA, USA null
BL21 Competent Cell Merck millipore,Germany 70232-3CN
BSA-100G Sigma-Aldrich, USA B2064-100G
Centrifuge 5810 R Eppendorf, Germany  5811000398
Coomassie bright blue G-250 staining solution MIKX,China DB236
Decolorization solution BOSTER,China AR0163-2
Electro-heating standing-temperature cultivator HH-B11-420 Shanghai Yuejin Medical Device Factory, China null
Electrophoresis apparatus Beijing Liuyi Instrument Factory, China DYCZ-25D
Gel image Tanon, USA null
Glutathione-Sepharose Resin GST Mei5bio,China affinity chromatography resin
H2SO4 Chengdu KESHI Chemical Co., LTD,China 7664-93-9
HI recombinant protein Third Military Medical University,China 110-27-0
HRP -Goat Anti-Mouse IgG Biodragon, China BF03001
HRP- Goat anti-mouse IgG1 Biodragon, China BF03002R
HRP- Goat anti-mouse IgG2a Biodragon, China BF03003R
HRP- Goat anti-mouse IgG2b Biodragon, China BF03004R
Inoculation loop Haimen Feiyue Co.,LTD,China YR-JZH-1UL
IsdB and Hla clones Shanghai Jereh Biotechnology Co,China null
Isopropyl nutmeg (pharmaceutic adjuvant) SEPPIC, France null
isopropyl- β-D-1-mercaptogalactopyranoside fdbio,China FD3278-1
LB bouillon culture-medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-136
Lnfrared physiotherapy lamp Guangzhou Runman Medical Equipment Co.,China 7600
Low temperature refrigerated centrifuge Eppendorf, Germany  null
Malvern NANO ZS Malvern Instruments Ltd., UK null
MH(A) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-051
MH(B) medium Beijing AOBOX Biotechnology Co., LTD,China 02-052
Micro plate washing machine 405 LSRS Bio Tek Instruments,Inc Highland  Park,USA null
Mini-TBC Compact Film Transfer Instrument BeiJingDongFangRuiLi Co.,LTD,China 1658030
MMC packing TOSOH(SHANGHAI)CO.,LTD 0022818
MRSA252 USA, ATCC null
Nanodrop ultraviolet spectrophotometer Thermo Scientific, USA null
New FlashTM Protein any KD PAGE Protein electrophoresis gel kit DAKEWE, China 8012011
PBS biosharp, China null
PCR, Amplifier Thermal Cycler, USA null
pGEX-target gene recombinant plasmid Shanghai Jereh Biotechnology Co,China B3528G
Phosphotungstic acid G-CLONE, China CS1231-25g
pipette Eppendorf, Germany  3120000844
polyoxyethylated castor oil (pharmaceutic adjuvant) Aladdin, China K400327-1kg
Primary antibody Laboratory homemade:from immunized mice with positive sera null See Reference 11 for details
propylene glycol (pharmaceutic adjuvant) Sigma-Aldrich, USA P4347-500ML
Protein Marker Thermo Scientufuc, USA 26616
PVDF TRANSFER MEMBRANE Invitrogen,USA 88518
Scanning Electron Microscope JEOL,Japan JSM-IT800
Sodium pentobarbital Merck,Germany Tc-P8411
Talos L120C TEM Thermo Fisher, USA null
TMB color solution TIAN GEN, China PA107-01
Turtle kits Xiamen Bioendo Technology Co.,LTD ES80545
Tween-20 Macklin, China 9005-64-5

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Diesen Artikel zitieren
Zeng, X., Sun, H., Ye, Y., Luo, X., Cai, D., Yang, Y., Chen, T., Sun, C., Zhang, S., Zeng, H. Evaluating the Immune Response of a Nanoemulsion Adjuvant Vaccine Against Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus (MRSA) Infection. J. Vis. Exp. (199), e65152, doi:10.3791/65152 (2023).

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