Qui descriviamo un test interno di attività del fattore tissutale del tessuto delle vescicole extracellulari. I saggi basati sull’attività e i saggi basati sull’antigene sono stati utilizzati per misurare il fattore tissutale nelle vescicole extracellulari da campioni di plasma umano. I test basati sull’attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull’antigene.
Il fattore tissutale (TF) è un recettore transmembrana per il fattore (F) VII e FVIIa. Il complesso TF/FVIIa avvia la cascata della coagulazione attivando sia FIX che FX. Il TF viene rilasciato dalle cellule nella circolazione sotto forma di vescicole extracellulari (EV). Il livello di vescicole extracellulari TF-positive (+) è aumentato in varie malattie, tra cui il cancro, le infezioni batteriche e virali e la cirrosi, ed è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità. Esistono due modi per misurare le vescicole extracellulari TF+ nel plasma: saggi basati sull’antigene e sull’attività. I dati indicano che i test basati sull’attività hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai test basati sull’antigene. Questo documento descrive il nostro saggio interno dell’attività EVTF basato su un saggio di generazione FXa a due stadi. FVIIa, FX e calcio vengono aggiunti ai campioni contenenti EV TF+ per generare FXa in presenza e assenza di anticorpi anti-TF per distinguere la generazione FXa TF-dipendente dalla generazione FXa TF-indipendente. Per determinare il livello di FXa viene utilizzato un substrato cromogenico scisso da FXa, mentre per la determinazione della concentrazione di TF viene utilizzata una curva standard generata con un TF ricombinante relipidato. Questo test di attività EVTF interno ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività TF commerciale.
La coagulazione del sangue inizia con il legame del fattore (F) VII/VIIa al fattore tissutale (TF)1. Il complesso TF/FVIIa attiva sia FIX che FX per attivare la coagulazione del sangue1. Esistono due forme di TF full-length, legate alla membrana: crittografato e attivo. Inoltre, esiste una forma alternativa di TF (asTF). La sfingomielina e la fosfatidilcolina nel lembo esterno della membrana cellulare mantengono il TF in uno stato crittografato 2,3,4. Quando le cellule sono attivate o danneggiate, la scramblasi fosfolipidica trasferisce la fosfatidilserina e altri fosfolipidi caricati negativamente al foglietto esterno1. L’attivazione delle cellule provoca anche la traslocazione della sfingomielinasi acida nel foglietto esterno dove degrada la sfingomielina in ceramide5. Questi due meccanismi convertono TF crittografato nel formato attivo. Si propone inoltre che la proteina disolfuro isomerasi medierà la formazione di legami disolfuro tra Cys186 e Cys209 in TF crittografato, che si traduce nella decodifica di TF 6,7,8. asTF è presente anche in circolo ma manca del dominio transmembrana ed è quindi solubile 9,10. È importante sottolineare che l’asTF ha livelli molto bassi di attività procoagulante rispetto al TFattivo 10,11 a tutta lunghezza.
Le vescicole extracellulari (EV) vengono rilasciate dalle cellule ospiti a riposo, attivate e morenti, nonché dalle cellule tumorali12. Le vescicole extracellulari esprimono proteine dalle loro cellule parentali12. Le vescicole extracellulari attive portatrici di TF vengono rilasciate dai monociti attivati, dalle cellule endoteliali e dalle cellule tumorali nella circolazione 13,14,15. I livelli di TF nel plasma possono essere misurati mediante saggi basati sull’attività e sull’antigene. I saggi basati sull’antigene includono l’ELISA e la citometria a flusso16. Esistono due diversi saggi basati sull’attività: saggi di attività TF a uno e due stadi. Il test a una fase si basa su un test di coagulazione basato sul plasma. Il campione contenente TF viene aggiunto al plasma e viene misurato il tempo necessario per formare un coagulo dopo la ricalcificazione. Il test a due stadi misura la generazione FXa dei campioni aggiungendo FVII o FVIIa, FX e calcio. I livelli di FXa sono determinati utilizzando un substrato che viene scisso da FXa.
Sia nei saggi di attività TF a uno che a due stadi, la concentrazione di TF viene determinata utilizzando una curva standard generata con TF ricombinante. I saggi a due stadi hanno una sensibilità e una specificità più elevate rispetto ai saggi a uno stadio. Molti studi hanno confermato che i saggi basati sull’attività hanno una maggiore sensibilità e specificità rispetto ai saggi basati sull’antigene 17,18,19,20,21. Inoltre, il nostro test di attività in-house ha una sensibilità e una specificità più elevate rispetto a un test di attività commerciale22. Gli individui sani hanno livelli molto bassi o non rilevabili di attività EVTF nel plasma. Al contrario, gli individui con condizioni patologiche, come cancro, cirrosi, sepsi e infezione virale, hanno livelli rilevabili di attività EVTF e questo è associato a trombosi, coagulazione intravascolare disseminata, gravità della malattia e mortalità 23,24,25,26,27,28. Qui, descriveremo questo test interno di attività EVTF a due stadi.
Qui viene presentato il protocollo del nostro test interno di attività EVTF. Il protocollo prevede tre passaggi critici. Quando si ricostituisce il pellet EV, è importante pipettare su e giù nella posizione del pellet EV anche se non è visibile. La ricostituzione incompleta del pellet EV comporterà un falso negativo o una sottostima dei valori di attività EVTF dei campioni. In secondo luogo, l’utilizzo di HBSA-Ca(+) è fondamentale nella fase 6.5 del protocollo perché la generazione di FXa non può essere generata…
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato sostenuto dal NIH NHLBI R35HL155657 (NM) e dalla cattedra John C. Parker (NM). Vorremmo ringraziare la signora Sierra J. Archibald per i suoi utili commenti
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |