Descrevemos aqui um ensaio in house de atividade do fator tecidual da vesícula extracelular. Ensaios baseados em atividade e ensaios baseados em antígenos têm sido usados para medir o fator tecidual em vesículas extracelulares de amostras de plasma humano. Os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos.
O fator tecidual (FT) é um receptor transmembrana para o fator (F) VII e FVIIa. O complexo TF/FVIIa inicia a cascata de coagulação ativando tanto o FIX quanto o FX. O FT é liberado das células para a circulação na forma de vesículas extracelulares (EVs). O nível de EVs TF-positivos (+) está aumentado em várias doenças, incluindo câncer, infecções bacterianas e virais e cirrose, e está associado a trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade. Existem duas maneiras de medir os EVs TF+ no plasma: ensaios baseados em antígeno e atividade. Os dados indicam que os ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios baseados em antígenos. Este artigo descreve nosso ensaio interno de atividade de EVTF baseado em um ensaio de geração FXa de dois estágios. FVIIa, FX e cálcio são adicionados às amostras contendo TF+ EV para gerar FXa na presença e ausência de anticorpo anti-TF para distinguir a geração FXa TF-dependente da geração FXa TF-independente. Um substrato cromogênico clivado por FXa é usado para determinar o nível de FXa, enquanto uma curva padrão gerada com um TF recombinante relipidado é usada para a determinação da concentração de FT. Este ensaio interno de atividade de EVTF tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio comercial de atividade de FT.
A coagulação sanguínea é iniciada com a ligação do fator (F) VII/VIIa ao fator tecidual (FT)1. O complexo TF/FVIIa ativa tanto o FIX quanto o FX para ativar a coagulação sanguínea1. Existem duas formas de TF completo, ligado à membrana: criptografado e ativo. Além disso, há uma forma alternativamente emendada de FT (asTF). A esfingomielina e a fosfatidilcolina no folheto externo da membrana celular mantêm os FT criptografados 2,3,4. Quando as células são ativadas ou danificadas, a scramblase fosfolipídica transfere fosfatidilserina e outros fosfolipídios carregados negativamente para o folheto externo1. A ativação celular também resulta na translocação da esfingomielinase ácida para o folheto externo, onde degrada a esfingomielina em ceramida5. Esses dois mecanismos convertem o TF criptografado para a forma ativa. Propõe-se também que a proteína dissulfeto isomerase medeia a formação de ligações dissulfeto entre Cys186 e Cys209 em FT criptografados, o que resulta na descriptografia de FT6,7,8. A ASTF também está presente na circulação, mas não possui o domínio transmembrana e, portanto, é solúvel 9,10. É importante ressaltar que o TF tem níveis muito baixos de atividade pró-coagulante em comparação com o TF ativo de comprimento total10,11.
As vesículas extracelulares (EVs) são liberadas das células do hospedeiro em repouso, ativadas e moribundas, bem como das células cancerígenas12. Os EVs expressam proteínas de suas células parentais12. Os EVs ativos portadores de FT são liberados de monócitos ativados, células endoteliais e células tumorais para a circulação 13,14,15. Os níveis de FT no plasma podem ser medidos por ensaios baseados em atividade e antígeno. Os ensaios baseados em antígenos incluem ELISA e citometria de fluxo16. Existem dois ensaios diferentes baseados em atividades: ensaios de atividade de TF de um e dois estágios. O ensaio de um estágio é baseado em um ensaio de coagulação à base de plasma. A amostra contendo TF é adicionada ao plasma e o tempo para formar um coágulo é medido após a recalcificação. O ensaio de dois estágios mede a geração FXa de amostras adicionando FVII ou FVIIa, FX e cálcio. Os níveis de FXa são determinados usando um substrato que é clivado por FXa.
Nos ensaios de atividade de FT em um e dois estágios, a concentração de FT é determinada usando uma curva padrão gerada com FT recombinante. Os ensaios em dois estágios têm maior sensibilidade e especificidade do que os ensaios em um estágio. Muitos estudos têm confirmado que ensaios baseados em atividade têm maior sensibilidade e especificidade do que ensaios baseados em antígenos17,18,19,20,21. Além disso, nosso ensaio de atividade interna tem maior sensibilidade e especificidade do que um ensaio de atividade comercial22. Indivíduos saudáveis têm níveis muito baixos ou indetectáveis de atividade da EVTF no plasma. Em contraste, indivíduos com condições patológicas, como câncer, cirrose, sepse e infecção viral, apresentam níveis detectáveis de atividade da FVE, o que está associado à trombose, coagulação intravascular disseminada, gravidade da doença e mortalidade 23,24,25,26,27,28. Aqui, descreveremos este ensaio interno de atividade de EVTF em dois estágios.
Aqui, o protocolo do nosso ensaio interno de atividade EVTF é apresentado. Há três etapas críticas no protocolo. Ao reconstituir a pelota de EV, é importante pipetar para cima e para baixo no local da pelota de EV, mesmo que ela não seja visível. A reconstituição incompleta da pastilha de EV resultará em um falso negativo ou subestimação dos valores de atividade de EVTF das amostras. Em segundo lugar, o uso de HBSA-Ca(+) é crítico na etapa 6.5 do protocolo porque a geração FXa não pode ser gerada sem cá…
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI R35HL155657 (N.M.) e pela cátedra John C. Parker (N.M.). Gostaríamos de agradecer à Sra. Sierra J. Archibald por seus comentários úteis
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |