Differenziazione delle linee del sistema nervoso enterico dalle cellule staminali pluripotenti umane
Summary
La derivazione di linee del sistema nervoso enterico (ENS) da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) fornisce una fonte scalabile di cellule per studiare lo sviluppo e la malattia dell’ENS e per l’uso nella medicina rigenerativa. Qui viene presentato un protocollo dettagliato in vitro per derivare neuroni enterici da hPSC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite.
Abstract
Il sistema nervoso enterico umano, ENS, è una vasta rete di tipi di cellule gliali e neuronali con una notevole diversità di neurotrasmettitori. L’ENS controlla la motilità intestinale, la secrezione enzimatica e l’assorbimento dei nutrienti e interagisce con il sistema immunitario e il microbioma intestinale. Di conseguenza, i difetti dello sviluppo e acquisiti dell’ENS sono responsabili di molte malattie umane e possono contribuire ai sintomi del morbo di Parkinson. Le limitazioni nei sistemi modello animale e l’accesso al tessuto primario pongono sfide sperimentali significative negli studi sull’ENS umano. Qui, viene presentato un protocollo dettagliato per un’efficace derivazione in vitro dei lignaggi ENS da cellule staminali pluripotenti umane, hPSC, utilizzando condizioni di coltura definite. Il nostro protocollo inizia con la differenziazione diretta delle hPSC in cellule della cresta neurale enterica entro 15 giorni e produce diversi sottotipi di neuroni enterici funzionali entro 30 giorni. Questa piattaforma fornisce una risorsa scalabile per studi sullo sviluppo, modellazione di malattie, scoperta di farmaci e applicazioni rigenerative.
Introduction
Il sistema nervoso enterico (ENS) è il componente più grande del sistema nervoso periferico. L’ENS contiene più di 400 milioni di neuroni che si trovano all’interno del tratto gastrointestinale e controllano quasi tutte le funzioni dell’intestino1. La comprensione molecolare dello sviluppo e della funzione dell’ENS e dei suoi difetti nelle neuropatie enteriche richiede l’accesso a una fonte affidabile e autentica di neuroni enterici. L’accesso al tessuto primario umano è limitato e i modelli animali non riescono a ricapitolare i fenotipi chiave della malattia in molte neuropatie enteriche. La tecnologia delle cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) si è dimostrata estremamente vantaggiosa nel fornire una fonte illimitata dei tipi di cellule desiderate, in particolare quelle che sono difficili da isolare da fonti primarie 2,3,4,5,6,7. Qui, forniamo i dettagli di un metodo in vitro graduale e robusto per ottenere colture ENS da hPSC. Queste colture scalabili derivate da hPSC aprono la strada per studi sullo sviluppo, modellazione della malattia e screening di farmaci ad alto rendimento e possono fornire cellule trapiantabili per la medicina rigenerativa.
Le linee neuronali enteriche derivano dalle cellule della cresta neurale (NC) che seguono il percorso di sviluppo dell’ENS durante l’embriogenesi. Negli embrioni, le cellule NC emergono lungo i margini della placca neurale ripiegata. Proliferano, migrano e danno origine a molti tipi di cellule diverse, tra cui neuroni sensoriali, cellule di Schwann, melanociti, scheletro craniofacciale e neuroni enterici e glia 8,9,10. La decisione sul destino cellulare dipende dalla regione distinta lungo l’asse antero-posteriore da cui emergono le cellule NC, cioè NC cranica, NC vagale, NC del tronco e NC sacrale. L’ENS si sviluppa da cellule NC vagali e sacrali, con le prime che dominano la popolazione dei neuroni enterici a causa dell’estesa migrazione lungo la lunghezza dell’intestino e colonizzano l’intestino11.
La derivazione di cellule NC da PSC comporta comunemente una combinazione di doppia inibizione SMAD e attivazione della via WNT12,13. Fino a poco tempo fa, tutti i protocolli di induzione NC coinvolgevano siero e altri additivi di prodotti animali nelle condizioni di coltura. I terreni chimicamente indefiniti non solo riducono la riproducibilità dell’induzione di NC, ma mettono anche in discussione gli studi meccanicistici sullo sviluppo. Per superare queste sfide, Barber et al14 hanno sviluppato un protocollo di induzione NC utilizzando condizioni di coltura chimicamente definite ed è stato quindi vantaggioso rispetto ai metodi alternativi che si basano su fattori di sostituzione del siero (ad esempio, KSR)13,14. Questo è stato ottenuto mediante sostituzioni di terreni basali e ottimizzando un protocollo originariamente presentato da Fattahi et al per derivare cellule NC enteriche da hPSC. Questo sistema migliorato è la base del protocollo di differenziazione hPSC qui presentato. Inizia con l’induzione delle cellule della cresta neurale enterica (ENC) in un periodo di 15 giorni mediante una modulazione precisa della segnalazione BMP, FGF, WNT e TGFβ oltre all’acido retinoico (RA). Quindi deriviamo i lignaggi ENS trattando le cellule con il fattore neurotrofico derivato dalla linea cellulare gliale (GDNF). Tutte le composizioni dei terreni sono chimicamente definite e producono robuste colture neuronali enteriche entro 30-40 giorni.
Oltre al sistema di coltura cellulare monostrato qui descritto, sono stati sviluppati approcci alternativi di induzione NC che utilizzano corpi embrioidi liberi fluttuanti15,16. È stato dimostrato che le cellule migratorie in queste colture esprimono marcatori NC con un sottogruppo che rappresenta la NC vagale. Le co-colture con tessuto intestinale primario sono state utilizzate per arricchire i precursori enterici della NC in queste colture. Le composizioni dei media in questi studi contengono una combinazione di diversi fattori come il fattore di crescita nervoso, NT3 e il fattore neurotrofico derivato dal cervello. In questa fase, non è del tutto chiaro come questi fattori possano influenzare le identità di impegno dei precursori dei neuroni enterici. Per un confronto efficiente dell’induzione enterica delle NC nel monostrato e nelle colture basate su corpi embrioidi sono necessari ulteriori dati. Dati i diversi layout culturali in queste strategie, l’uso di ciascun metodo dovrebbe essere considerato e ottimizzato in base all’applicazione specifica in mente.
Il protocollo qui presentato è riproducibile ed è stato testato con successo da noi e da altri utilizzando diverse linee di hPSC (indotte ed embrionali) 8,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo di differenziazione qui descritto fornisce un robusto metodo in vitro per ottenere neuroni enterici da hPSC entro 30-40 giorni (Figura 1E) e glia enterica che esprimono proteina acida fibrillare gliale, GFAP e SOX10 in colture più vecchie (> giorno 55)13,14,19,22. Questi neuroni e la glia sono indotti dalla differenziazione graduale delle hP…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni del Programma UCSF per la ricerca biomedica rivoluzionaria e della Sandler Foundation, dalla sovvenzione March of Dimes n. 1-FY18-394 e 1DP2NS116769-01, dal NIH Director’s New Innovator Award (DP2NS116769) a F.F. e dal National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (R01DK121169) a F.F., H.M. è supportato dalla borsa di studio post-dottorato della Larry L. Hillblom Foundation, Borsa di studio NIH T32-DK007418 e borsa di studio post-dottorato indipendente UCSF Program for Breakthrough Biomedical Research.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Referenzen
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
