Diferenciação de linhagens do sistema nervoso entérico de células-tronco pluripotentes humanas
Summary
A derivação de linhagens do sistema nervoso entérico (ENS) de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) fornece uma fonte escalável de células para estudar o desenvolvimento e a doença do ENS e para usar na medicina regenerativa. Aqui, é apresentado um protocolo in vitro detalhado para derivar neurônios entéricos de hPSCs usando condições de cultura quimicamente definidas.
Abstract
O sistema nervoso entérico humano, ENS, é uma grande rede de tipos de células gliais e neuronais com notável diversidade de neurotransmissores. O ENS controla a motilidade intestinal, a secreção enzimática e a absorção de nutrientes e interage com o sistema imunológico e o microbioma intestinal. Consequentemente, os defeitos de desenvolvimento e adquiridos do SNE são responsáveis por muitas doenças humanas e podem contribuir para os sintomas da doença de Parkinson. Limitações em sistemas de modelos animais e acesso ao tecido primário representam desafios experimentais significativos em estudos do ENS humano. Aqui, um protocolo detalhado é apresentado para a derivação in vitro eficaz das linhagens ENS de células-tronco pluripotentes humanas, hPSC, usando condições de cultura definidas. Nosso protocolo começa com a diferenciação direcionada de hPSCs em células da crista neural entérica em 15 dias e produz diversos subtipos de neurônios entéricos funcionais em 30 dias. Essa plataforma fornece um recurso escalável para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças, descoberta de medicamentos e aplicações regenerativas.
Introduction
O sistema nervoso entérico (SNE) é o maior componente do sistema nervoso periférico. O ENS contém mais de 400 milhões de neurônios localizados no trato gastrointestinal e controlam quase todas as funções do intestino1. A compreensão molecular do desenvolvimento e função do SNE e seus defeitos nas neuropatias entéricas requer acesso a uma fonte confiável e autêntica de neurônios entéricos. O acesso ao tecido primário humano é limitado e os modelos animais não conseguem recapitular os principais fenótipos da doença em muitas neuropatias entéricas. A tecnologia de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) provou ser extremamente benéfica no fornecimento de uma fonte ilimitada de tipos de células desejados, especialmente aquelas que são difíceis de isolar de fontes primárias 2,3,4,5,6,7. Aqui, fornecemos detalhes de um método in vitro passo a passo e robusto para obter culturas ENS de hPSCs. Essas culturas escaláveis derivadas de hPSC abrem caminhos para estudos de desenvolvimento, modelagem de doenças e triagem de medicamentos de alto rendimento e podem fornecer células transplantáveis para medicina regenerativa.
As linhagens de neurônios entéricos são derivadas de células da crista neural (NC) que seguem o caminho de desenvolvimento do SNE durante a embriogênese. Nos embriões, as células NC emergem ao longo das margens da placa neural dobrável. Eles proliferam, migram e dão origem a muitos tipos de células diferentes, incluindo neurônios sensoriais, células de Schwann, melanócitos, esqueleto craniofacial e neurônios entéricos e glia 8,9,10. A decisão do destino celular depende da região distinta ao longo do eixo ântero-posterior de onde emergem as células NC, ou seja, NC craniana, NC vagal, NC do tronco e NC sacral. O SNE se desenvolve a partir de células NC vagais e sacrais, com a primeira dominando a população de neurônios entéricos devido à extensa migração ao longo do intestino e colonizando o intestino11.
A derivação de células NC de PSCs geralmente envolve uma combinação de inibição dupla de SMAD e ativação da via WNT12,13. Até recentemente, todos os protocolos de indução de NC envolviam soro e outros aditivos de produtos de origem animal nas condições de cultura. Meios quimicamente indefinidos não apenas reduzem a reprodutibilidade da indução de NC, mas também desafiam os estudos de desenvolvimento mecanicista. Para superar esses desafios, Barber et al14 desenvolveram um protocolo de indução de NC usando condições de cultura quimicamente definidas e, portanto, foi vantajoso em relação a métodos alternativos que dependem de fatores de reposição de soro (por exemplo, KSR) 13 , 14 . Isso foi obtido por substituições de meios basais e otimizando um protocolo originalmente apresentado por Fattahi et al para derivar células NC entéricas de hPSCs. Este sistema aprimorado é a base do protocolo de diferenciação de hPSC que é apresentado aqui. Começa com a indução de células da crista neural entérica (ENC) em um período de 15 dias por modulação precisa da sinalização BMP, FGF, WNT e TGFβ, além do ácido retinóico (RA). Em seguida, derivamos as linhagens ENS tratando células com fator neurotrófico derivado de linhagem de células gliais (GDNF). Todas as composições de meios são quimicamente definidas e produzem culturas neuronais entéricas robustas dentro de 30 a 40 dias.
Além do sistema de cultura de células em monocamada descrito aqui, foram desenvolvidas abordagens alternativas de indução de NC que usam corpos embrióides flutuantes 15,16. As células migratórias nessas culturas demonstraram expressar marcadores NC com um subconjunto representando o NC vagal. Co-culturas com tecido intestinal primário têm sido usadas para enriquecer precursores entéricos de NC nessas culturas. As composições de mídia nesses estudos contêm uma combinação de diferentes fatores, como fator de crescimento nervoso, NT3 e fator neurotrófico derivado do cérebro. Nesta fase, não está totalmente claro como esses fatores podem afetar as identidades de comprometimento do precursor do neurônio entérico. Para uma comparação eficiente da indução de NC entérica nas culturas baseadas em monocamada e corpo embrióide, são necessários mais dados. Dadas as diferentes configurações de cultura nessas estratégias, o uso de cada método deve ser considerado e otimizado de acordo com a aplicação específica em mente.
O protocolo aqui apresentado é reprodutível e foi testado com sucesso por nós e outros usando diferentes linhagens de hPSC (induzida e embrionária) 8,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo de diferenciação descrito aqui fornece um método in vitro robusto para obter neurônios entéricos de hPSCs dentro de 30-40 dias (Figura 1E) e glia entérica expressando proteína glial fibrilar ácida, GFAP e SOX10 em culturas mais antigas (> dia 55) 13 , 14 , 19 , 22 . Esses neurônios e glia são induzidos pela diferenciação gradual de …
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
O trabalho foi apoiado por doações do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora e da Fundação Sandler, March of Dimes concessão nº 1-FY18-394 e 1DP2NS116769-01, o Prêmio Novo Inovador do Diretor do NIH (DP2NS116769) para F.F. e o Instituto Nacional de Diabetes e Doenças Digestivas e Renais (R01DK121169) para F.F., H.M. é apoiado pela bolsa de pós-doutorado da Fundação Larry L. Hillblom, bolsa NIH T32-DK007418 e bolsa de pós-doutorado independente do Programa UCSF para Pesquisa Biomédica Inovadora.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Referenzen
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