Diferenciación de linajes del sistema nervioso entérico a partir de células madre pluripotentes humanas
Summary
La derivación de linajes del sistema nervioso entérico (SNE) a partir de células madre pluripotentes humanas (hPSC) proporciona una fuente escalable de células para estudiar el desarrollo y la enfermedad del SNE, y para su uso en medicina regenerativa. Aquí, se presenta un protocolo detallado in vitro para derivar neuronas entéricas a partir de hPSCs utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas.
Abstract
El sistema nervioso entérico humano, ENS, es una gran red de tipos de células gliales y neuronales con una notable diversidad de neurotransmisores. El SNE controla la motilidad intestinal, la secreción de enzimas y la absorción de nutrientes, e interactúa con el sistema inmunitario y el microbioma intestinal. En consecuencia, los defectos de desarrollo y adquiridos del SNE son responsables de muchas enfermedades humanas y pueden contribuir a los síntomas de la enfermedad de Parkinson. Las limitaciones en los sistemas de modelos animales y el acceso al tejido primario plantean importantes desafíos experimentales en los estudios del SNE humano. Aquí, se presenta un protocolo detallado para la derivación efectiva in vitro de los linajes ENS a partir de células madre pluripotentes humanas, hPSC, utilizando condiciones de cultivo definidas. Nuestro protocolo comienza con la diferenciación dirigida de hPSCs a células de cresta neural entérica en un plazo de 15 días y produce diversos subtipos de neuronas entéricas funcionales en un plazo de 30 días. Esta plataforma proporciona un recurso escalable para estudios de desarrollo, modelado de enfermedades, descubrimiento de fármacos y aplicaciones regenerativas.
Introduction
El sistema nervioso entérico (SNE) es el componente más grande del sistema nervioso periférico. El SNE contiene más de 400 millones de neuronas que se encuentran dentro del tracto gastrointestinal y controlan casi todas las funciones del intestino. La comprensión molecular del desarrollo y la función del SNE y sus defectos en las neuropatías entéricas requiere el acceso a una fuente fiable y auténtica de neuronas entéricas. El acceso al tejido primario humano es limitado, y los modelos animales no logran recapitular los fenotipos clave de la enfermedad en muchas neuropatías entéricas. La tecnología de células madre pluripotentes humanas (hPSC) ha demostrado ser extremadamente beneficiosa para proporcionar una fuente ilimitada de los tipos de células deseados, especialmente aquellas que son difíciles de aislar de las fuentes primarias 2,3,4,5,6,7. Aquí, proporcionamos detalles de un método in vitro robusto y escalonado para obtener cultivos de ENS a partir de hPSCs. Estos cultivos escalables derivados de hPSC abren vías para los estudios de desarrollo, el modelado de enfermedades y el cribado de fármacos de alto rendimiento, y pueden proporcionar células trasplantables para la medicina regenerativa.
Los linajes de neuronas entéricas se derivan de las células de la cresta neural (NC) que siguen la ruta de desarrollo del ENS durante la embriogénesis. En los embriones, las células NC emergen a lo largo de los márgenes de la placa neural plegada. Proliferan, migran y dan lugar a muchos tipos diferentes de células, incluidas las neuronas sensoriales, las células de Schwann, los melanocitos, el esqueleto craneofacial y las neuronas entéricas y la glía 8,9,10. La decisión sobre el destino de la célula depende de la región distinta a lo largo del eje anteroposterior de la que emergen las células NC, es decir, NC craneal, NC vagal, NC troncal y NC sacra. El SNE se desarrolla a partir de células NC vagales y sacras, dominando las primeras la población de neuronas entéricas debido a la extensa migración a lo largo del intestino y colonizando el intestino11.
La derivación de células NC a partir de PSCs comúnmente implica una combinación de inhibición dual de SMAD y activación de la vía WNT12,13. Hasta hace poco, todos los protocolos de inducción de NC incluían aditivos de suero y otros productos animales en las condiciones de cultivo. Los medios químicamente indefinidos no solo reducen la reproducibilidad de la inducción de NC, sino que también desafían los estudios mecanicistas del desarrollo. Para superar estos desafíos, Barber et al14 desarrollaron un protocolo de inducción de NC utilizando condiciones de cultivo químicamente definidas y, por lo tanto, fue ventajoso sobre los métodos alternativos que dependen de factores de reemplazo sérico (por ejemplo, KSR)13,14. Esto se obtuvo mediante reemplazos de medios basales y optimización de un protocolo presentado originalmente por Fattahi et al para derivar células NC entéricas a partir de hPSCs. Este sistema mejorado es la base del protocolo de diferenciación de hPSC que se presenta aquí. Comienza con la inducción de las células de la cresta neural entérica (ENC) en un período de 15 días mediante la modulación precisa de la señalización de BMP, FGF, WNT y TGFβ además del ácido retinoico (AR). A continuación, derivamos los linajes de ENS mediante el tratamiento de células con factor neurotrófico derivado de líneas celulares gliales (GDNF). Todas las composiciones de los medios están definidas químicamente y producen cultivos neuronales entéricos robustos en un plazo de 30 a 40 días.
Además del sistema de cultivo celular monocapa descrito aquí, se han desarrollado enfoques alternativos de inducción de NC que utilizan cuerpos embrioides que flotan libremente15,16. Se ha demostrado que las células migratorias en estos cultivos expresan marcadores NC con un subconjunto que representa el NC vagal. Se han utilizado cocultivos con tejido intestinal primario para enriquecer los precursores entéricos de NC en estos cultivos. Las composiciones de los medios en estos estudios contienen una combinación de diferentes factores, como el factor de crecimiento nervioso, NT3 y el factor neurotrófico derivado del cerebro. En esta etapa, no está completamente claro cómo estos factores podrían afectar las identidades de compromiso de los precursores de neuronas entéricas. Para una comparación eficiente de la inducción entérica de NC en los cultivos monocapa y en los cultivos basados en cuerpos embrioides, se necesitan más datos. Teniendo en cuenta los diferentes diseños de cultura en estas estrategias, el uso de cada método debe considerarse y optimizarse de acuerdo con la aplicación específica en mente.
El protocolo presentado aquí es reproducible y ha sido probado con éxito por nosotros y otros utilizando diferentes líneas de hPSC (inducidas y embrionarias) 8,14,16.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo de diferenciación descrito aquí proporciona un método robusto in vitro para obtener neuronas entéricas de hPSCs en un plazo de 30-40 días (Figura 1E) y glía entérica que expresa proteína ácida fibrilar glial, GFAP y SOX10 en cultivos más antiguos (> día 55)13,14,19,22. Estas neuronas y glía son inducidas por la diferenciación esca…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por subvenciones del Programa de Investigación Biomédica Innovadora de la UCSF y la Fundación Sandler, la subvención n.º 1-FY18-394 y 1DP2NS116769-01 de March of Dimes, el Premio al Nuevo Innovador del Director de los NIH (DP2NS116769) a F.F. y el Instituto Nacional de Diabetes y Enfermedades Digestivas y Renales (R01DK121169) a F.F., H.M. cuenta con el apoyo de la beca postdoctoral de la Fundación Larry L. Hillblom, Beca T32-DK007418 de los NIH y beca postdoctoral independiente del Programa de Investigación Biomédica Innovadora de la UCSF.
Materials
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| B27 supplement (serum free, minus vitamin A) | Gibco | 12587-010 | |
| Basement membrane matrix, Geltrex | Gibco | A14133-2 | |
| BMP4 | R&D systems | 314-BP | |
| Cell culture centrifuge | Eppendorf, model no. 5810R | 02262501 | |
| Cell detachment solution, Accutase | Stemcell Technologies | 07920 | |
| CHIR99021 | Tocris | 4423 | |
| Conical tubes | USA scientific | 1475-0511, 1500-1211 | |
| Differentiation base medium, Essential 6 | Life Technologies | A1516401 | |
| DMEM/F-12 no glutamine | Life Technologies | 21331020 | |
| EDTA | Corning | MT-46034CI | |
| Feeder-free hPSC maintenance medium, Essential 8 Flex Medium Kit | Life Technologies | A2858501 | |
| FGF2 | R&D systems | 233-FB/CF | |
| Fibronectin | Corning | 356008 | |
| GDNF | Peprotech | 450-10 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1475 | |
| Human pluripotent stem cells, H9 ESC | WiCell | RRID: CVCL_1240 | |
| Incubator with controlled humidity, temperature and CO2 | Thermo Fisher Scientific | Herralcell 150i | |
| Inverted microscope | Thermo Fisher Scientific | EVOS FL | |
| Laminar flow hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series class II, type A2 | |
| Laminin | Cultrex | 3400-010 | |
| L-glutamine supplement, Glutagro | Corning | 25-015-CI | |
| MEM NEAAs | Corning | 25-025-CI | |
| Multiwell plates, Falcon | BD | 353934, 353075 | |
| N-2 Supplement | CTS | A1370701 | |
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103049 | |
| PBS (Ca and Mg free) | Life Technologies | 10010023 | |
| Pipette filler | Eppendorf | Z768715-1EA | |
| Pipette tips | USA scientific | 1111-2830 | |
| Pipettes | Fisherbrand | 13-678-11E, 13-678-11F | |
| PO | Sigma-Aldrich | P3655 | |
| polymer coverslip bottom imaging plates, ibidi | ibidi | 81156 | |
| RA | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| SB431542 | R&D systems | 1614 | |
| Trypan blue stain, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250-061 | |
| Ultra-low attachment plates | Fisher Scientific | 07-200-601 | |
| Y-27632 dihydrochloride | R&D systems | 1254 |
Referenzen
- Gershon, M. D. The enteric nervous system: a second brain. Hosp Pract. 34 (7), 35-38 (1999).
- Haggarty, S. J., Silva, M. C., Cross, A., Brandon, N. J., Perlis, R. H. Advancing drug discovery for neuropsychiatric disorders using patient-specific stem cell models. Mol Cell Neurosci. 73, 104-115 (2016).
- Bose, A., Petsko, G. A., Studer, L. Induced pluripotent stem cells: a tool for modeling Parkinson’s disease. Trends Neurosci. 45 (8), 608-620 (2022).
- Liu, C., Oikonomopoulos, A., Sayed, N., Wu, J. C. Modeling human diseases with induced pluripotent stem cells: from 2D to 3D and beyond. Dev Camb Engl. 145 (5), (2018).
- Marchetto, M. C. N., et al. A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells. Cell. 143 (4), 527-539 (2010).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461 (7262), 402-406 (2009).
- Shyamala, K., Yanduri, S., Girish, H. C., Murgod, S. Neural crest: The fourth germ layer. J Oral Maxillofac Pathol. 19 (2), 221-229 (2015).
- Crane, J. F., Trainor, P. A. Neural crest stem and progenitor cells. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 267-286 (2006).
- Thomas, S., et al. Human neural crest cells display molecular and phenotypic hallmarks of stem cells. Hum Mol Genet. 17 (21), 3411-3425 (2008).
- Heanue, T. A., Pachnis, V. Enteric nervous system development and Hirschsprung’s disease: advances in genetic and stem cell studies. Nat Rev Neurosci. 8, 466-479 (2007).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3 (4), 1140-1152 (2013).
- Fattahi, F., et al. Deriving human ENS lineages for cell therapy and drug discovery in Hirschsprung disease. Nature. 531 (7592), 105-109 (2016).
- Barber, K., Studer, L., Fattahi, F. Derivation of enteric neuron lineages from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 14 (4), 1261-1279 (2019).
- Li, W., et al. Characterization and transplantation of enteric neural crest cells from human induced pluripotent stem cells. Mol Psychiatry. 23 (3), 499-508 (2018).
- Workman, M. J., et al. Engineered human pluripotent-stem-cell-derived intestinal tissues with a functional enteric nervous system. Nat Med. 23, 49-59 (2017).
- Southard-Smith, E. M., Kos, L., Pavan, W. J. Sox10 mutation disrupts neural crest development in Dom Hirschsprung mouse model. Nat Genet. 18 (1), 60-64 (1998).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (12), 1468-1475 (2007).
- Majd, H., et al. hPSC-derived enteric ganglioids model human ENS development and function. BioRxiv. , (2022).
- Majd, H., et al. Deriving Schwann cells from hPSCs enables disease modeling and drug discovery for diabetic peripheral neuropathy. Cell Stem Cell. 30 (5), 632-647 (2023).
- Samuel, R. M., et al. Generation of Schwann cell derived melanocytes from hPSCs identifies pro-metastatic factors in melanoma. BioRxiv. , (2023).
- Richter, M. N., et al. Inhibition of muscarinic receptor signaling protects human enteric inhibitory neurons against platin chemotherapy toxicity. BioRxiv. , (2023).
