Génération de rétine neurale à partir de cellules souches pluripotentes humaines
Summary
Le présent protocole décrit un système optimisé d’induction neuronale de la rétine en 3D qui réduit l’adhésion et la fusion des organoïdes rétiniens avec une répétabilité et une efficacité élevées.
Abstract
La rétinopathie est l’une des principales causes de cécité dans le monde. L’étude de sa pathogenèse est essentielle pour le diagnostic précoce et le traitement rapide de la rétinopathie. Malheureusement, des obstacles éthiques entravent la collecte de preuves auprès des humains. Récemment, de nombreuses études ont montré que les cellules souches pluripotentes humaines (CSP) peuvent être différenciées en organoïdes rétiniens (OI) à l’aide de différents protocoles d’induction, qui ont un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation de la maladie, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches. Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé pour générer une rétine neurale (NR) qui réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion, augmentant ainsi le taux de réussite de la production jusqu’au 60e jour. Basée sur la capacité des CSP à s’auto-réorganiser après dissociation, combinée à certains facteurs complémentaires, cette nouvelle méthode peut spécifiquement conduire à la différenciation des NR. De plus, l’approche est simple, rentable, présente une répétabilité et une efficacité remarquables, présente des perspectives encourageantes pour les modèles personnalisés de maladies rétiniennes et fournit un réservoir cellulaire abondant pour des applications telles que la thérapie cellulaire, le criblage de médicaments et les tests de thérapie génique.
Introduction
L’œil est la principale source d’information parmi les organes sensoriels humains, la rétine étant le principal tissu sensoriel visuel des yeux des mammifères1. La rétinopathie est l’une des principales causes mondiales de maladies oculaires, conduisant à la cécité2. Environ 2,85 millions de personnes dans le monde souffrent de divers degrés de déficience visuelle due à la rétinopathie3. Par conséquent, l’étude de sa pathogenèse est cruciale pour un diagnostic précoce et un traitement rapide. La plupart des études sur la rétinopathie humaine se sont principalement concentrées sur des modèles animaux 4,5,6. Cependant, la rétine humaine est un tissu complexe et multicouche comprenant différents types de cellules. Les systèmes traditionnels de culture cellulaire bidimensionnelle (2D) et de modèles animaux ne parviennent généralement pas à récapituler fidèlement le développement spatio-temporel normal et le métabolisme des médicaments de la rétine humaine native 7,8.
Récemment, les techniques de culture 3D ont évolué pour générer des organes ressemblant à des tissus à partir de cellules souches pluripotentes (CSP)9,10. Les organoïdes rétiniens (OI) générés à partir de CSP humaines dans un système de culture en suspension 3D contiennent non seulement sept types de cellules rétiniennes, mais présentent également une structure stratifiée distincte similaire à la rétine humaine in vivo 11,12,13. Les OI dérivées de CSP humaines ont gagné en popularité et sont largement disponibles et sont actuellement les meilleurs modèles in vitro pour étudier le développement et la maladie de la rétine humaine14,15. Au cours des dernières décennies, de nombreux chercheurs ont démontré que les CSP humaines, y compris les cellules souches embryonnaires (CSE) et les cellules souches pluripotentes induites (CSPi), peuvent se différencier en OI à l’aide de divers protocoles d’induction. Ces progrès présentent un énorme potentiel dans la rétinopathie pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les thérapies à base de cellules souches 16,17,18.
Cependant, la génération de rétine neurale (NR) à partir de cellules souches pluripotentes humaines (CSP) est un processus complexe, lourd et long. De plus, les variations d’un lot à l’autre dans les organoïdes tissulaires peuvent entraîner une reproductibilité plus faible des résultats19,20. De nombreux facteurs intrinsèques et extrinsèques peuvent influencer le rendement des organoïdes rétiniens (OI), tels que le nombre ou l’espèce de cellules de départ et l’utilisation de facteurs de transcription et de composés à petites molécules 21,22,23. Depuis que la première OI humaine a été générée par le laboratoire Sasai11, de multiples modifications ont été proposées au fil des ans pour améliorer la facilité et l’efficacité du processus d’induction 13,21,24,25. Malheureusement, à ce jour, aucun protocole de référence n’a été établi pour générer des OI dans tous les laboratoires. En effet, il existe un certain degré de divergence dans les OI résultant des différentes méthodes d’induction, ainsi qu’une grande variation dans l’expression des marqueurs rétiniens et la robustesse de leur structure22,26. Ces problèmes peuvent compliquer considérablement la collecte des échantillons et l’interprétation des résultats de l’étude. Par conséquent, un protocole de différenciation plus consolidé et plus robuste est nécessaire pour maximiser l’efficacité avec une hétérogénéité minimale de la génération d’OI.
Cette étude décrit un protocole d’induction optimisé basé sur une combinaison de Kuwahara et al.12 et Döpper et al.27 avec des instructions détaillées. La nouvelle méthode réduit considérablement la probabilité de vésiculation et de fusion des organoïdes, augmentant ainsi le taux de réussite de la génération de NR. Ce développement est très prometteur pour la modélisation des maladies, le criblage de médicaments et les applications de thérapie cellulaire pour les troubles rétiniens.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les OI humaines peuvent récapituler spatialement et temporellement le développement de la rétine fœtale, et les OI précoces présentent un degré élevé de similitude avec la rétine fœtale à des stades de développement équivalents15. En termes de morphologie tissulaire et d’expression moléculaire, l’OI humaine reflète étroitement l’état de croissance réel du tissu rétinien, offrant des opportunités énormes et sans précédent dans les domaines de la modélisation des malad…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Aucun.
Materials
| 0.01 M TPBS | Servicebio | G0002 | Washing slices |
| 4% Paraformaldehyde | Servicebio | G1101-500ML | Fix retinal organoids |
| 5 mL Pasteur pipette | NEST Biotechnology | 318516 | Pipette retinal organoids |
| 96 V-bottomed conical wells | Sumitomo Bakelit | MS-9096VZ | |
| Adhesion Microscope Slides | CITOTEST | 188105 | Fix slices |
| AggreWell medium | STEMCELL Technologies | 5893 | Medium |
| Anhydrous ethanol | SINOPHARM | 10009218 | Dehydrate |
| Anti-CHX10 | Santa Cruz | sc-365519 | Primary antibody |
| Antifade Solution | ZSGB-BIO | ZLI-9556 | |
| Anti-KI67 | Abcam | ab16667 | Primary antibody |
| Anti-NESTIN | Sigma | N5413 | Primary antibody |
| Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1) | Beyotime | AT809 | Primary antibody |
| Anti-PAX6 | Abcam | ab195045 | Primary antibody |
| Cell dissociation solution(CDS) | STEMCELL Technologies | 7922 | Cell dissociation |
| CHIR99021 | Selleckchem | S2924 | GSK-3α/β inhibitor |
| Cholesterol Lipid Concentrate | Gibco | 12531018 | 250× |
| Citrate Antigen Retrieval Solution | Servicebio | G1202-250ML | 20×, pH 6.0 |
| CS10 | STEMCELL Technologies | 1001061 | Cell Freezing Medium |
| DAPI | Roche | 10236276001 | Nuclear counterstain |
| Dimethyl sulfoxide(DMSO) | Sigma | D2650 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11330032 | Medium |
| DMEM/F12-GlutaMAX | Gibco | 10565018 | Medium |
| Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488 | Invitrogen | A32766 | Secondary Antibody |
| Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A10042 | Secondary Antibody |
| Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Biosharp | BL518A | 0.5 M, pH 8.0, cell dissociation |
| Extracellular matrix (ECM) | Corning | 354277 | Coating plates |
| F12-Glutamax | Gibco | 31765035 | Medium |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | A5669701 | |
| Flow-like tissue cell quantitative analyzer | TissueGnostics | TissueFAXS Plus | Scan sections |
| IMDM-GlutaMAX | Gibco | 31980030 | Medium |
| IWR1-endo | Selleckchem | S7086 | Wnt-inhibitor |
| KnockOut Serum Replacement | Gibco | 10828028 | |
| LDN-193189 2HCl | Selleckchem | S7507 | BMP-inhibitor |
| Low-adhesion 24-well Plates | Corning | 3473 | |
| Low-adhesion 6-well Plates | Corning | 3471 | |
| Maintenance medium (MM) | STEMCELL Technologies | 85850 | Medium |
| N2 supplement | Gibco | 17502048 | |
| Normal Donkey Serum | Solarbio | SL050 | Blocking buffer |
| Paraplast | Leica | 39601006 | Tissue embedding |
| PBS pH 7.4 basic (1x) | Gibco | C10010500BT | Without Ca+,Mg+ |
| Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4) | R&D | 314-BP | Key protein factor |
| Retinoic acid | Sigma | R2625 | Powder, keep out of light |
| SB431542 | Selleckchem | S1067 | ALK5-inhibitor |
| SU5402 | Selleckchem | S7667 | Tyrosine kinase inhibitor |
| Super PAP Pen | ZSGB-BIO | ZLI-9305 | |
| Taurine | Sigma | T0625-10G | |
| Thioglycerol | Sigma | M1753 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100 | Permeabilization |
| WA09 embryonic stem cell line | WiCell Research Institute | Cell line | |
| Xylene | SINOPHARM | 10023418 | Dewaxing |
| Y-27632 2HCL | Selleckchem | S1049 | ROCK-inhibitor |
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