Real-time polymerasekettingreactie-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus-DNA

Summary

Real-time polymerasekettingreactie (PCR)-gebaseerde detectie en kwantificering van hepatitis B-virus (HBV)-DNA is een gevoelige en nauwkeurige methode voor het diagnosticeren en bewaken van HBV-infectie. Hier presenteren we een protocol voor HBV-DNA-detectie en de viral load-meting van een monster.

Abstract

Het hepatitis B-virus (HBV) is wereldwijd een belangrijke oorzaak van leveraandoeningen. Het kan leiden tot acute of chronische infecties, waardoor personen zeer vatbaar zijn voor fatale cirrose en leverkanker. Nauwkeurige detectie en kwantificering van HBV-DNA in het bloed zijn essentieel voor het diagnosticeren en bewaken van HBV-infectie. De meest gebruikelijke methode voor het detecteren van HBV-DNA is real-time PCR, die kan worden gebruikt om het virus te detecteren en de virale lading te beoordelen om de respons op antivirale therapie te volgen. Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de detectie en kwantificering van HBV-DNA in menselijk serum of plasma met behulp van een IVD-gemarkeerde real-time PCR-gebaseerde kit. De kit maakt gebruik van primers en sondes die zich richten op het sterk geconserveerde kerngebied van het HBV-genoom en kan alle HBV-genotypen (A, B, C, D, E, F, G, H, I en J) nauwkeurig kwantificeren. De kit bevat ook een endogene interne controle om mogelijke PCR-remming te monitoren. Deze test duurt 40 cycli en de grenswaarde is 38 Ct. Voor de kwantificering van HBV-DNA in klinische monsters wordt een set van 5 kwantificeringsstandaarden bij de kit geleverd. De standaarden bevatten bekende concentraties HBV-specifiek DNA die zijn gekalibreerd tegen de 4e internationale WHO-standaard voor HBV-DNA voor de nucleïnezuurtest (NIBSC-code 10/266). De standaarden worden gebruikt om de functionaliteit van de HBV-specifieke DNA-amplificatie te valideren en om een standaardcurve te genereren, waardoor HBV-DNA in een monster kan worden gekwantificeerd. HBV-DNA van slechts 2,5 IE/ml werd gedetecteerd met behulp van de PCR-kit. De hoge gevoeligheid en reproduceerbaarheid van de kit maken het een krachtig hulpmiddel in klinische laboratoria en helpt beroepsbeoefenaren in de gezondheidszorg bij het effectief diagnosticeren en beheersen van HBV-infecties.

Introduction

Hepatitis B-virus (HBV) is een gedeeltelijk dubbelstrengs DNA-virus uit het geslacht Orthohepadnavirus en de familie Hepadnaviridae ¹. Het kan een chronische infectie veroorzaken die het hele leven aanhoudt, wat mogelijk kan leiden tot levercirrose en hepatocellulair carcinoom ^2,3,4. Volgens de Wereldgezondheidsorganisatie (WHO) leefden in 2019 naar schatting 296 miljoen mensen met een chronische hepatitis B-infectie en werden elk jaar 1,5 miljoen mensen nieuw besmet⁵.

De identificatie en meting van HBV-DNA in serum- of plasmamonsters dienen als een waardevolle methode voor het detecteren van personen met een aanhoudende hepatitis B-infectie, het beoordelen van de werkzaamheid van antivirale behandeling en het voorspellen van de waarschijnlijkheid van succes van de behandeling 6,7,8,9,10,11. Een hoge virale lading wordt in verband gebracht met een verhoogd risico op progressie van leverziekte, waaronder cirrose en leverkanker^12,13. Daarom is nauwkeurige meting van de virale lading cruciaal voor het volgen van de progressie van HBV-infectie en het informeren van beslissingen over behandeling.

Kwantitatieve real-time PCR-assays hebben een hogere gevoeligheid, een breder dynamisch bereik en een nauwkeurigere kwantificering van HBV-DNA dan conventionele PCR-technieken 14,15,16,17. Er zijn verschillende commerciële real-time PCR-gebaseerde moleculaire diagnostische kits op de markt voor de kwantificering van HBV-DNA in serum- of plasmamonsters. Hier beschrijven we een gedetailleerde workflow voor de detectie en kwantificering van HBV-DNA in menselijk serum of plasma met behulp van een in de handel verkrijgbare, IVD-gemarkeerde real-time PCR-gebaseerde kit. De kit is een veelgebruikte ^18,19, goedkope, maar zeer gevoelige test, en de prestatiekenmerken zijn vergelijkbaar met andere in de handel verkrijgbare CE-gemarkeerde kit(s)¹⁸. Afgezien van de amplificatie van het HBV-doelgebied, is ook een endogeen intern controlegen in de kit opgenomen om de kwaliteit van monsters, de kwaliteit van geëxtraheerd DNA, PCR-amplificatie en mogelijke PCR-remming te verifiëren.

Protocol

Bij deze studie waren geen menselijke deelnemers of klinische monsters betrokken. Het enige biologische materiaal dat werd gebruikt, was de 4e internationale norm van de WHO voor HBV-DNA voor nucleïnezuurtest (NIBSC-code 10/266). Deze norm is een openbaar beschikbaar referentiemateriaal dat geen persoonlijke informatie of identificeerbare gegevens bevat. Als zodanig was er geen ethische goedkeuring vereist voor deze studie. 1. DNA-extractie Extraheer het …

Representative Results

Figuur 1 toont een schematisch diagram van de workflow voor het detecteren en kwantificeren van HBV-DNA uit humaan plasma/serum. Figuur 2 toont een versterkingsgrafiek van Standaard 2 (gebruikt als PC) en NTC voor zowel HBV als IC. Figuur 3 toont de amplificatiecurven voor een HBV-positief monster, een HBV-negatief monster en een monster met PCR-remming. De amplificatiecurve, de Ct-waarde voor HBV en de verkregen HBV-concentratie in…

Discussion

NIBSC-code 10/266 heeft een eenheid toegewezen gekregen van 9,55,000 IE/ml wanneer deze wordt gereconstitueerd in 0.5 ml nucleasevrij water volgens de leveranciersinformatie²¹. Dit kan worden beschouwd als een HBV-positief monster met hoge belasting. De HBV-virale lading bepaald door de virale belastingskit die in deze studie werd gebruikt, was 6,65,900 IE/ml (Figuur 4). Omdat de DNA-extractie-efficiëntie van een DNA-extractiekit niet 100% is, gaat er vaak wat DNA ve…

Materials

4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198