A detecção e quantificação do DNA do vírus da hepatite B (HBV) baseada na reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real é um método sensível e preciso para diagnosticar e monitorar a infecção pelo HBV. Aqui, apresentamos um protocolo para detecção do DNA do VHB e a medição da carga viral de uma amostra.
O vírus da hepatite B (VHB) é uma importante causa de doença hepática em todo o mundo. Pode levar a infecções agudas ou crônicas, tornando os indivíduos altamente suscetíveis à cirrose fatal e ao câncer de fígado. A detecção e quantificação precisas do DNA do VHB no sangue são essenciais para o diagnóstico e monitoramento da infecção pelo VHB. O método mais comum para detectar o DNA do VHB é a PCR em tempo real, que pode ser usada para detectar o vírus e avaliar a carga viral para monitorar a resposta à terapia antiviral. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para a detecção e quantificação do DNA do VHB em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com DIV. O kit usa primers e sondas que têm como alvo a região central altamente conservada do genoma do HBV e podem quantificar com precisão todos os genótipos do HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). O kit também inclui um controle interno endógeno para monitorar uma possível inibição da PCR. Este ensaio tem duração de 40 ciclos, e seu ponto de corte é de 38 Ct. Para a quantificação do DNA do VHB em amostras clínicas, um conjunto de 5 padrões de quantificação é fornecido com o kit. Os padrões contêm concentrações conhecidas de DNA específico para HBV que são calibradas de acordo com a4ª Norma Internacional da OMS para DNA de HBV para o teste de ácido nucleico (código NIBSC 10/266). Os padrões são usados para validar a funcionalidade da amplificação de DNA específico para HBV e gerar uma curva padrão, permitindo a quantificação do DNA do HBV em uma amostra. DNA do VHB tão baixo quanto 2,5 UI/mL foi detectado usando o kit de PCR. A alta sensibilidade e reprodutibilidade do kit o tornam uma ferramenta poderosa em laboratórios clínicos, auxiliando os profissionais de saúde no diagnóstico e manejo efetivo das infecções por HBV.
O vírus da hepatite B (VHB) é um vírus de DNA parcialmente de fita dupla do gênero Orthohepadnavirus e da família Hepadnaviridae 1. Pode desencadear uma infecção crônica que persiste por toda a vida, podendo levar à cirrose hepática e ao carcinoma hepatocelular2,3,4. De acordo com a Organização Mundial da Saúde (OMS), uma população estimada de 296 milhões de pessoas vivia com infecção crônica por hepatite B em 2019, e 1,5 milhão de pessoas foram infectadas a cada ano5.
A identificação e a dosagem do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma servem como um método valioso para detectar indivíduos com infecção contínua pelo vírus da hepatite B, avaliar a eficácia do tratamento antiviral e predizer a probabilidade de sucesso do tratamento 6,7,8,9,10,11. A alta carga viral está associada a um risco aumentado de progressão da doença hepática, incluindo cirrose e câncer hepático12,13. Assim, a mensuração precisa da carga viral é crucial para acompanhar a progressão da infecção pelo VHB e informar as decisões sobre o tratamento.
Ensaios quantitativos de PCR em tempo real apresentam maior sensibilidade, maior faixa dinâmica e quantificação mais precisa do DNA do VHB do que as técnicas convencionais de PCR 14,15,16,17. Vários kits comerciais de diagnóstico molecular baseados em PCR em tempo real para a quantificação do DNA do VHB em amostras de soro ou plasma estão disponíveis no mercado. Aqui, descrevemos um fluxo de trabalho detalhado para a detecção e quantificação do DNA do HBV em soro ou plasma humano usando um kit baseado em PCR em tempo real marcado com IVD disponível comercialmente. O kit é um ensaio amplamenteutilizado18,19, de baixo custo, porém altamente sensível, e suas características de desempenho são comparáveis a outros kits com marcação CE disponíveis comercialmente18. Além da amplificação da região-alvo do VHB, um gene de controle interno endógeno também está incluído no kit para verificar a qualidade das amostras, qualidade do DNA extraído, amplificação por PCR e possível inibição da PCR.
O código NIBSC 10/266 recebeu uma unidade de 9,55.000 UI/mL quando reconstituída em 0,5 mL de água livre de nucleases, de acordo com as informações do fornecedor21. Esta pode ser considerada uma amostra positiva para VHB de alta carga. A carga viral do VHB determinada pelo kit de carga viral utilizado neste estudo foi de 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Como a eficiência de extração de DNA de qualquer kit de extração de DNA não é de 100%, parte do DNA é frequen…
The authors have nothing to disclose.
Agradecemos a Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita e Shikha por sua assistência técnica.
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA | NIBSC | NIBSC code: 10/266 | The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT). |
ABI real-time PCR machines | ThermoFisher Scientific | ABI 7500; QuantStudio 5 | This is a real time PCR machine |
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198 | NIBSC | NIBSC code: 14/198 | This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1) |
QIAGEN real-time PCR machine | Qiagen | Rotor-Gene Q | This is a real time PCR machine |
TRUPCR HBV Viral Load kit | Kilpest India Limited | 3B294 | This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination |
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit | Kilpest India Limited | 3B214 | This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198 |