Allevamento di Axenic Delia antiqua con diete sterili semifermentate
Summary
Viene descritta una semplice procedura per l’allevamento di Delia antiqua axenica con diete sterili semifermentate. Solo un ceppo di Wolbachia è stato rilevato in ogni stadio di D. antiqua axenico utilizzando la PCR.
Abstract
Gli insetti axenici sono ottenuti da sistemi di allevamento artificiale sterili che utilizzano terreni sterili. Questi insetti, caratterizzati da piccole dimensioni, breve ciclo di crescita e basso fabbisogno alimentare, sono ideali per studiare la relazione tra microrganismi e ospiti. Il microbiota intestinale influenza in modo significativo le caratteristiche fisiologiche degli insetti ospiti e l’introduzione di ceppi specifici negli insetti axenici fornisce un metodo per verificare le funzioni microbiche intestinali. La Delia antiqua, un parassita minaccioso dell’ordine dei Ditteri, della famiglia Anthomyiidae e del genere Delia, si nutre principalmente di cipolle, aglio, porri e altri ortaggi della famiglia delle Liliaceae. Le sue larve si nutrono dei bulbi, causando marciume, appassimento e persino la morte di intere piante. Allevando larve axeniche, è possibile condurre studi di follow-up per osservare gli effetti della microflora intestinale sulla crescita e sullo sviluppo di D. antiqua. A differenza del metodo che prevede l’eliminazione antibiotica dei microbi associati, questo articolo presenta un approccio a basso costo e ad alta efficienza per l’allevamento di D. antiqua axenico. Dopo la sterilizzazione superficiale delle uova di D. antiqua , sono state utilizzate diete sterili semifermentate per allevare le larve e lo stato axenico di D. antiqua è stato verificato attraverso saggi dipendenti dalla coltura e indipendenti dalla coltura. In conclusione, la combinazione della sterilizzazione delle uova di insetti e la preparazione di diete sterili per la coltura larvale ha permesso lo sviluppo di un metodo efficiente e semplice per ottenere D. antiqua axenico. Questo metodo fornisce un potente approccio allo studio delle interazioni tra insetti e microflora.
Introduction
Gli animali axenici, definiti come animali in cui non è possibile rilevare microrganismi o parassiti vitali, sono validi modelli sperimentali per lo studio delle interazioni ospite-microrganismo 1,2. Gli insetti, il gruppo più numeroso di invertebrati, possono formare relazioni simbiotiche con i microrganismi3. Gli insetti axenici possono essere utilizzati per studiare le interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici4. Ad esempio, Nishide et al.5 hanno stabilito una pratica procedura di allevamento sterile per il verme maleodorante Plautia stali, consentendo un’analisi affidabile e rigorosa delle interazioni ospite-simbionte in sistemi simbiotici modello. Gli insetti axenici possono essere prodotti sterilizzando lo stadio di uovo e fornendo cibo sterile alle larve e agli adulti 6,7. Gli insetti axenici sono di grande importanza e sono ampiamente utilizzati nella ricerca biologica. Ad esempio, uno studio condotto da Somerville et al.8 ha dimostrato che le falene diamondback inoculate con cloache di Enterobacter hanno migliorato l’adattabilità dei maschi transgenici.
La Delia antiqua Meigen è un parassita economicamente importante per le cipolle e altre colture di Liliaceae in tutto il mondo, con le sue larve che danneggiano i bulbi delle cipolle e di altre colture di Liliaceae9. D. antiqua si trova principalmente nei climi temperati ed è diffusa nelle aree di coltivazione delle cipolle delle Americhe, dell’Europa e dell’Asia. Se non adeguatamente controllata, può causare perdite di raccolto nelle cipolle (Allium cepa L.), nell’aglio (Allium sativum L.), nello scalogno (Allium fistulosum L.) e nei porri (Alliumchoenoprasum L.) che vanno dal 50% al 100%10,11. Le larve si nutrono delle parti sotterranee delle piante e questa alimentazione fa appassire le piantine e alla fine morire. Inoltre, le piante danneggiate possono consentire l’ingresso di agenti patogeni, portando alla decomposizione del bulbo12. Anche se le piante non vengono completamente consumate dalle larve, i danni che provocano rendono le piante di cipolla non commerciabili e si traducono in perdite economiche.
Gli insetti sono strettamente associati al microbiota intestinale e la maggior parte delle viscere degli insetti contiene una varietà di batteri simbionti che prosperano grazie ai nutrienti forniti dall’ospite13,14. Jing et al.15 hanno dimostrato che la funzione primaria della comunità simbiotica intestinale è quella di fornire nutrienti essenziali, seguiti da funzioni legate alla digestione e alla disintossicazione. In alcuni casi, i batteri intestinali possono fungere da risorsa microbica per scopi di gestione dei parassiti. Di conseguenza, è auspicabile studiare le prestazioni dei singoli batteri intestinali e le funzioni specifiche all’interno del corpo di D. antiqua. Pertanto, la preparazione di larve axeniche è particolarmente importante per studiare le interazioni tra specifici ceppi batterici e insetti16. Attualmente, un metodo comunemente usato per eliminare i batteri intestinali degli insetti è l’uso di una combinazione di antibiotici per sradicare i microbi associati 17,18,19. A differenza dell’uso dei soli antibiotici, che possono solo ridurre il numero di microbi, l’allevamento axenico degli insetti consente di controllare la composizione e la quantità di microrganismi, consentendo una convalida più accurata della funzionalità del microbiota intestinale.
Pertanto, questo articolo introduce un protocollo per la preparazione e l’allevamento di D. antiqua axenico. Il cibo larvale Axenic è ottenuto utilizzando la sterilizzazione ad alta temperatura di diete naturali combinate con alimenti semifermentati. Le uova vengono sterilizzate seguendo un protocollo sperimentale per ottenere le uova axeniche e, infine, le larve axeniche vengono coltivate dalle uova axeniche. Il sistema di allevamento axenico è stato effettuato per una sola generazione per l’esperimento. Ciò fornirà comodità per studiare l’interazione tra insetti e microbiota intestinale.
Protocol
Representative Results
Discussion
Gli insetti possiedono un microbiota intestinale altamente complesso 20,21, che richiede l’uso di insetti axenici inoculati con ceppi microbici intestinali specifici per studiare le interazioni insetto-microrganismo. La preparazione di insetti axenici è fondamentale per tali attività di ricerca. Il trattamento antibiotico è un metodo utilizzato per eliminare il microbiota intestinale. Ad esempio, Jung e Kim22 hanno nutrito Spodopter…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (32272530), dal progetto New Twenty Policies for University in Jinan (2021GXRC040), dai principali progetti di innovazione scientifica e tecnologica nella provincia di Shandong (2021TZXD002) e dal progetto di integrazione scientifica e didattica della Qilu University of Technology (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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