Criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas
Summary
Um procedimento simples para a criação de Delia antiqua axênica com dietas estéreis semi-fermentadas é descrito. Apenas uma cepa de Wolbachia foi detectada em cada ínstar de D. antiqua axênica por PCR.
Abstract
Os insetos axênicos são obtidos a partir de sistemas de criação artificial estéreis usando meios estéreis. Esses insetos, caracterizados por seu pequeno tamanho, ciclo de crescimento curto e baixa exigência alimentar, são ideais para estudar a relação entre microrganismos e hospedeiros. A microbiota intestinal influencia significativamente as características fisiológicas dos insetos hospedeiros, e a introdução de cepas específicas em insetos axênicos fornece um método para verificar as funções microbianas intestinais. Delia antiqua, uma praga ameaçadora da ordem Diptera, família Anthomyiidae e gênero Delia, alimenta-se principalmente de cebola, alho, alho-poró e outros vegetais da família Liliaceae. Suas larvas se alimentam dos bulbos, causando apodrecimento, murcha e até morte de plantas inteiras. Através da criação de larvas axênicas, estudos de seguimento podem ser realizados para observar os efeitos da microflora intestinal sobre o crescimento e desenvolvimento de D. antiqua. Ao contrário do método que envolve a eliminação antibiótica de micróbios associados, este artigo apresenta uma abordagem de baixo custo e alta eficiência para a elevação de D. antiqua axênica. Após a esterilização superficial dos ovos de D. antiqua , dietas estéreis semifermentadas foram utilizadas para criar larvas, e o estado axênico de D. antiqua foi verificado através de ensaios dependentes e independentes de cultura. Conclui-se que a combinação da esterilização de ovos de insetos e o preparo de dietas estéreis para cultivo de larvas possibilitou o desenvolvimento de um método eficiente e simples para obtenção de D. antiqua axênica. Este método fornece uma abordagem poderosa para estudar interações inseto-microflora.
Introduction
Animais axênicos, definidos como animais nos quais não é possível detectar microrganismos ou parasitas viáveis, são modelos experimentais valiosos para o estudo das interações hospedeiro-microrganismo1,2. Os insetos, o maior grupo de invertebrados, podem formar relações simbióticas com microrganismos3. Insetos axênicos podem ser usados para estudar interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos4. Por exemplo, Nishide et al.5 estabeleceram um procedimento prático de criação estéril para o verme de mau odor Plautia stali, permitindo uma análise confiável e rigorosa das interações simbionte hospedeiro em sistemas simbióticos modelo. Insetos axênicos podem ser produzidos esterilizando-se a fase de ovo e fornecendo alimento estéril às larvas e adultos 6,7. Insetos axênicos são de grande importância e são amplamente utilizados em pesquisas biológicas. Por exemplo, um estudo conduzido por Somerville et al.8 demonstrou que mariposas diamondback inoculadas com Enterobacter cloacae melhoraram a adaptabilidade de machos transgênicos.
Delia antiqua Meigen é uma praga economicamente importante da cebola e de outras culturas Liliaceae em todo o mundo, com suas larvas danificando os bulbos da cebola e de outras culturas de Liliaceae9. D. antiqua é encontrada principalmente em climas temperados e é amplamente difundida em áreas de cultivo de cebola das Américas, Europa e Ásia. Se não controlada adequadamente, pode causar perdas de cultura em cebola (Allium cepa L.), alho (Allium sativum L.), chalotas (Allium fistulosum L.) e alho-poró (Alliumchoenoprasum L.) variando de 50% a 100%10,11. As larvas se alimentam das partes abaixo do solo das plantas, e essa alimentação faz com que as mudas murchem e, eventualmente, morram. Além disso, plantas danificadas podem permitir a entrada de patógenos, levando ao apodrecimento do bulbo12. Mesmo que as plantas não sejam completamente consumidas pelas larvas, os danos que elas causam tornam as plantas de cebola incomercializáveis e resultam em perdas econômicas.
Os insetos estão intimamente associados à microbiota intestinal, e a maioria dos intestinos de insetos contém uma variedade de bactérias simbióticas que prosperam com os nutrientes fornecidos pelo hospedeiro13,14. Jing et al.15 mostraram que a função primária da comunidade simbiótica intestinal é fornecer nutrientes essenciais, seguida de funções relacionadas à digestão e desintoxicação. Em certos casos, as bactérias intestinais podem servir como um recurso microbiano para fins de manejo de pragas. Consequentemente, estudar o desempenho das bactérias intestinais individuais e funções específicas dentro do corpo de D. antiqua é desejável. Portanto, o preparo de larvas axênicas é particularmente importante para o estudo das interações entre cepas bacterianas específicas e insetos16. Atualmente, um método comumente utilizado para eliminar bactérias intestinais de insetos é o uso de uma combinação de antibióticos para erradicar micróbios associados 17,18,19. Ao contrário do uso isolado de antibióticos, que só podem reduzir o número microbiano, a criação axênica de insetos permite o controle sobre a composição e a quantidade de microrganismos, permitindo uma validação mais precisa da funcionalidade da microbiota intestinal.
Assim, este artigo apresenta um protocolo para o preparo e criação de D. antiqua axênico. O alimento axênico para larvas é obtido utilizando a esterilização a alta temperatura de dietas naturais combinadas com alimentos semifermentados. Os ovos são esterilizados seguindo um protocolo experimental para obtenção de ovos axênicos e, finalmente, larvas axênicas são cultivadas a partir dos ovos axênicos. O sistema de criação axênico foi realizado por apenas uma geração para o experimento. Isso proporcionará conveniência para estudar a interação entre insetos e microbiota intestinal.
Protocol
Representative Results
Discussion
Os insetos possuem uma microbiota intestinal altamente complexa20,21, sendo necessário o uso de insetos axênicos inoculados com cepas microbianas intestinais específicas para o estudo das interações inseto-microrganismo. A preparação de insetos axênicos é crucial para tais esforços de pesquisa. O tratamento com antibióticos é um método usado para eliminar a microbiota intestinal. Por exemplo, Jung e Kim22 alimentaram Spodo…
Offenlegungen
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (32272530), pelo Projeto Novas Vinte Políticas para a Universidade em Jinan (2021GXRC040), Grandes Projetos de Inovação Científica e Tecnológica na Província de Shandong (2021TZXD002) e pelo Projeto de Integração de Ciência e Educação da Universidade de Tecnologia Qilu (2022PYI009, 2022PY016, 2022PT105).
Materials
| 0.22 μM filter bottle | Thermo Scientific | 450-0045 | |
| 0.22 μM Syringe Filter | Biosharp | BS-QT-011 | |
| 100-mesh sieve | Zhejiang Shangyu Jinding Standard Sieve Factory | No Catalog numbers | |
| 1x PBS solution | Solarbio | P1020 | |
| 2x Taq PCR Master Mix | GENVIEW | GR1113-1ML | |
| 5.2% NaClO solution | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 80010428 | |
| 500 mL Conical flask | Thermo Scientific | 4103-0500 | |
| 50 mL vented centrifuge tube | JET BIOFIL | BRT-011-050 | |
| 50x TAE buffer | GENVIEW | GT1307 | |
| Agar powder | Ding Guo | DH010-1.1 | |
| Biochemical incubator | STIK | 21040121500010 | |
| Cell sieve | SAINING | 5022200 | |
| Choline chloride | Sangon Biotech | A600299-0100 | |
| ddH2O | Ding Guo | PER018-2 | |
| Disposable grinding pestle | JET BIOFIL | CSP-003-002 | |
| DNA extraction kit | Sangon Biotech | B518221-0050 | |
| DNA Marker | Sangon Biotech | B600335-0250 | |
| Ethanol absolute | Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. | 10009218 | |
| Filter paper | NEWSTAR | 1087309025 | |
| Food processor | Guangdong Midea Life Electric Appliance Manufacturing Co., Ltd. | WBL25B26 | |
| Illuminated incubator | Shanghai ESTABLISH Instrumentation Co., Ltd. | A16110768 | |
| L-Ascorbic acid | Sangon Biotech | A610021-0100 | |
| L-shaped spreader | SAINING | 6040000 | |
| Nutrient agar medium | Hope Bio | HB0109 | |
| Scissors | Bing Yu | BY-103 | Purchase on Jingdong |
| Shock incubator | Shanghai Zhichu Instrument Co., Ltd. | 2020000014 | |
| Sucrose | GENVIEW | CS326-500G | |
| Super Green nucleic acid dye | Biosharp | BS355A | |
| Super-clean table | Heal Force | AC130052 | |
| TSB | Hope Bio | HB4114 | |
| Vacuum pump | Zhejiang Taizhou Seeking Precision Vacuum Pump Co., Ltd. | 22051031 | |
| Yeast extract | Thermo Scientific | LP0021B |
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